黑小麥麥麩多糖的制備與分析

孫元琳陜 方劉惠芳張俊明

(運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系1,運(yùn)城 044000)

(山西省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品綜合利用研究所2,太原 030031)

(山西省運(yùn)城河?xùn)|烏麥研究開發(fā)中心3,運(yùn)城 044000)

黑小麥麥麩多糖的制備與分析

孫元琳1陜 方2劉惠芳3張俊明1

(運(yùn)城學(xué)院生命科學(xué)系1,運(yùn)城 044000)

(山西省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品綜合利用研究所2,太原 030031)

(山西省運(yùn)城河?xùn)|烏麥研究開發(fā)中心3,運(yùn)城 044000)

分別以水和飽和Ba(OH)2溶液為提取介質(zhì),采用高壓輔助水提取、Ba(OH)2堿提取和堿后水提取等方法制備黑小麥麥麩中的水溶性和水不溶性多糖,并采用氣相色譜(GC)、高效液相色譜 (HPLC)和紅外光譜(IR)分析黑小麥麥麩多糖組分的理化性質(zhì)。結(jié)果表明:高壓輔助水提組分(WEPH)主要由葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖 (Ara)和木糖(Xyl)組成,是β-葡聚糖和戊聚糖的混合物;Ba(OH)2堿提組分(AEPH)主要由Ara和Xyl組成,物質(zhì)的量比為 Ara:Xyl=1:1.66,表明含有較純的戊聚糖,其 Ara/Xyl比值為 0.60;堿后水提組分(AEPH-H2O)的 85%由葡萄糖(Glc)和半乳糖 (Man)組成,主要為β-葡聚糖和阿拉伯半乳聚糖,以及少量戊聚糖。富含戊聚糖的AEPH組分相對(duì)分子質(zhì)量最高,為 3.81×105,而以β-葡聚糖為主的WEPH和AEPH -H2O組分的相對(duì)分子質(zhì)量較低,其中單一峰組分AEPH-H2O為 2.40×105。

黑小麥 多糖 提取 戊聚糖 β-葡聚糖

黑小麥?zhǔn)呛瘫究埔荒晟耘喙任?主要用于制作面包和其他食品,以及作為動(dòng)物飼料和發(fā)酵培養(yǎng)基[1-2]。黑小麥麩皮是黑小麥加工的副產(chǎn)物,其膳食纖維含量豐富,主要為戊聚糖、β-葡聚糖和纖維素。此外,尚含有少量葡甘露聚糖、阿拉伯半乳聚糖及微量木葡聚糖等半纖維素[3]。

目前,國內(nèi)對(duì)黑小麥戊聚糖的研究主要集中在黑小麥粉中戊聚糖粗提物的應(yīng)用[4-5],對(duì)于黑小麥麩皮戊聚糖及其他半纖維素的研究卻鮮有報(bào)道。本試驗(yàn)以黑小麥麥麩為原料,采用不同方法對(duì)其多糖物質(zhì)進(jìn)行制備,通過純度和單糖組成分析,探索黑小麥麥麩中不同多糖組分的制備方法,以期為進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)表征及功能性質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

河?xùn)|烏麥:運(yùn)城市河?xùn)|烏麥黑色食品有限公司提供。

標(biāo)準(zhǔn)單糖:Sigma公司。牛血清蛋白、苯酚、三氟乙酸、氫氧化鋇和硼氫化鉀等試劑均為分析純。

GC-14A型氣相色譜儀:日本 Shimadzu公司; Waters 2690型高效液相色譜儀:美國 Waters公司; TENSOR27型傅里葉變換紅外光譜儀:德國布魯克公司;DSX-280A型高壓滅菌鍋:上海申安醫(yī)療器械廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料的預(yù)處理

將黑小麥麩皮粉碎,過 40目篩。用 80%的乙醇溶液于 80℃熱處理原料 2次,抽濾,真空干燥,得到預(yù)處理黑小麥麥麩。

1.2.2 高壓輔助水提組分WEPH的提取工藝

預(yù)處理黑小麥麥麩于 40℃水中攪拌 40 min→離心(3000 r/min,20 min)去除淀粉→離心后的沉淀用熱水于高壓輔助(0.12MPa,121℃)浸提 2次→離心→合并上清液,調(diào)至pH 4.5→離心去除蛋白 →上清液濃縮 →加 2倍 95%乙醇,靜置 →過濾 →沉淀復(fù)溶,透析 →冷凍干燥 →高壓輔助水提組分WEPH

1.2.3 Ba(OH)2堿提組分AEPH的提取工藝

熱水提取后的沉淀用飽和 Ba(OH)2溶液、1% KBH4于室溫提取 2次→離心→合并上清液,調(diào)至pH 4.5→離心→上清液濃縮 →加 2倍 95%乙醇,靜置 →過濾 →沉淀復(fù)溶,透析 →冷凍干燥 →Ba(OH)2堿提組分AEPH

1.2.4 堿后水提組分AEPH-H2O的提取工藝

堿提取后的沉淀于室溫再次用水提取 2次→離心→合并上清液,調(diào)至 pH 4.5→離心→上清液濃縮 →加 2倍 95%乙醇,靜置 →過濾 →沉淀復(fù)溶,透析 →冷凍干燥 →堿后水提組分AEPH-H2O

1.2.5 多糖含量測(cè)定

苯酚 -硫酸法[6],以一定比例的葡萄糖、阿拉伯糖和木糖為標(biāo)準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

Lowry法[7]。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7 多糖得率和純度的計(jì)算

1.2.8 單糖組成分析

將多糖樣品 5 mg溶于 2 mol/L的 TFA溶液,于100℃水解 4 h。水解液除盡過量的 TFA后,采用糖腈乙酸酯衍生化法衍生。反應(yīng)產(chǎn)物直接進(jìn)樣作氣相色譜 (GC)分析,根據(jù)出峰時(shí)間判斷單糖種類,根據(jù)峰面積的比值確定各單糖間的比例關(guān)系。采用 DB -1701毛細(xì)管色譜柱(0.53 mm×30 m),載氣為N2,流速 1.5 mL/min,FI D氫焰檢測(cè)器,汽化室溫度 260℃,檢測(cè)器溫度 260℃。采用程序升溫:起始溫度120℃(2 min)→195℃(10℃/min,1 min)→240℃(3℃ /min,10 min)。進(jìn)樣量:0.8μL。

校正因子的測(cè)定和計(jì)算:準(zhǔn)確稱取烘干的標(biāo)準(zhǔn)單糖,按上述方法進(jìn)行糖腈乙酰化和 GC測(cè)定。各標(biāo)準(zhǔn)單糖的校正因子 K=As×W i/Ai×W s

式中:As為標(biāo)準(zhǔn)單糖的峰面積,W i為內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量,Ai為內(nèi)標(biāo)的峰面積,W s為標(biāo)準(zhǔn)單糖的質(zhì)量。

1.2.9 多糖的 HPLC純度鑒定及相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

將相對(duì)分子質(zhì)量分別為 6 100、16 500、26 290、40 000、84 000、158 000的標(biāo)準(zhǔn) Dextran相繼進(jìn)樣,記錄保留時(shí)間 TR,以 TR為橫坐標(biāo),Lg M為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得回歸方程。待測(cè)樣品進(jìn)樣 20μL,根據(jù)所得的 TR,通過回歸方程計(jì)算多糖的相對(duì)分子質(zhì)量。采用色譜柱 Waters Ultrahydrogel T M Linear(ф 7.8 mm×300 mm)兩柱串連,檢測(cè)器為Waters 2410示差折光檢測(cè)器,以 0.1 mol/L NaNO3為流動(dòng)相,流速 0.9 mL/min,柱溫 45℃。

1.2.10 紅外光譜(IR)分析

取樣品微量,采用 KBr研磨壓片后,在 4 000～ 400 cm-1紅外波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

2 結(jié)果與討論

2.1 原料的預(yù)處理

多糖的相對(duì)分子質(zhì)量大小是其發(fā)揮生理功能的重要因素,而存在于原料中的內(nèi)源性碳水化合物酶,往往會(huì)降解多糖,導(dǎo)致相對(duì)分子質(zhì)量下降。因此,在提取多糖之前對(duì)原料麩皮進(jìn)行滅酶處理十分必要。用 80%的乙醇于 80℃下高溫處理,一方面使內(nèi)源酶失活,防止酶在提取過程中對(duì)多糖的降解,另一方面去除單糖、低聚糖、酚酸、色素和低聚肽等小分子物質(zhì),有利于提高粗多糖的純度。經(jīng)乙醇預(yù)處理后,黑小麥麥麩的得率為 79.96%,表明約 20%的小分子物質(zhì)被除去,有利于進(jìn)一步得到高純度的黑小麥麥麩多糖。

2.2 多糖的制備、得率和化學(xué)組成

黑小麥麥麩中的多糖物質(zhì)除纖維素、木質(zhì)素外,主要是戊聚糖,以及少量β-葡聚糖和其他半纖維素。根據(jù)其溶解性的不同分為水溶性和水不溶性多糖,可分別采用水和堿液提取。堿液中的 OH–有助于解除細(xì)胞壁聚合物分子間的物理和化學(xué)作用,促進(jìn)細(xì)胞壁融脹、結(jié)構(gòu)疏松,使不溶性聚合物成為水溶性,增加多糖的提取率[8]。

以 H2O和 Ba(OH)2為提取介質(zhì)對(duì)黑小麥麥麩多糖進(jìn)行系列提取,得到 3個(gè)不同的多糖組分,分別為高壓輔助水提組分 WEPH、Ba(OH)2堿提組分AEPH和堿后水提組分AEPH-H2O。不同提取方法所得多糖組分的得率和組成見表 1。

表1 不同粗多糖組分的得率與化學(xué)組成

結(jié)果顯示,高壓輔助水提組分 WEPH得率為9.39%,占總得率(22.86%)的 41.07%;Ba(OH)2堿提組分AEPH得率為 5.84%,占總得率的 25.55%,堿后水提組分 AEPH-H2O的得率為 7.63%,占總得率的 33.38%。

從表1中可以看出,WEPH和AEPH的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為 72.56%和 78.49%。兩種多糖樣品均含有一定量的蛋白,其中WEPH的蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù) (18. 57%)最高。堿后水提粗多糖組分AEPH-H2O的多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 84.43%,且不含蛋白。

細(xì)胞壁中蛋白質(zhì)與半纖維素之間以共價(jià)鍵緊密締合,而與纖維素、木質(zhì)素等其他多聚物通過氫鍵等次級(jí)鍵結(jié)合。WEPH和 AEPH均含有較高的蛋白,表明高壓輔助提取和堿液更容易破壞氫鍵等次級(jí)鍵的結(jié)合力,由于蛋白質(zhì)與半纖維素之間的共價(jià)鍵結(jié)合緊密,在多糖提取的過程中被一并溶出。經(jīng)高壓輔助提取和堿提后,堿后水提粗多糖組分AEPH-H2O經(jīng)檢測(cè)不含有蛋白。

2.3 單糖組分分析

采用氣相色譜測(cè)定了粗多糖樣品的單糖組成,見表2。

表 2 不同多糖組分的單糖組成a

表 2顯示,WEPH主要由葡萄糖 (Glc)組成,并含有少量阿拉伯糖(Ara)、木糖 (Xyl),以及微量的半乳糖(Gal)。其單糖組成摩爾比為Ara:Xyl:Glc= 1:3.78:12.72。單糖組成表明,黑小麥麥麩的高壓輔助水提組分主要為β-葡聚糖(73%)和戊聚糖(27%)的混合物,且富含β-葡聚糖。戊聚糖的Ara/Xyl比值為 0.26,表明Ara的取代度比較低。

除含有微量的 Glc,Ba(OH)2堿提組分AEPH主要由阿拉伯糖 (Ara)和木糖 (Xyl)組成,其含量超過95%,物質(zhì)的量比為 Ara:Xyl=1:1.66,表明AEPH富含戊聚糖。由此可初步判斷,黑小麥麥麩的Ba(OH)2堿提組分含有較純的戊聚糖。其 Ara/Xyl比值為 0.60,表明AHPH的Ara取代度高于高壓輔助水提組分WEPH。

堿后水提組分AEPH-H2O為不溶于Ba(OH)2溶液,但經(jīng)堿液處理后溶于水的多糖組分。主要由葡萄糖(Glc)和半乳糖(Man)組成(85%),并含有約 15%的Ara和Xyl,其物質(zhì)的量比為Ara:Xyl:Glc:Gal= 1:1.80:7.35:7.70。由此可知,堿后水提組分主要為β-葡聚糖和阿拉伯半乳聚糖,以及少量戊聚糖。戊聚糖的Ara/Xyl比值為 0.56,略低于AEPH。

2.4 相對(duì)分子質(zhì)量分布

采用 HPGPC凝膠色譜柱對(duì)不同粗多糖組分的相對(duì)分子質(zhì)量分布進(jìn)行測(cè)定如圖 1所示。

圖1 HPGPC測(cè)定不同多糖組分的相對(duì)分子質(zhì)量分布

比較圖 1可以看出,WEPH的凝膠柱洗脫曲線有多個(gè)洗脫峰,且相對(duì)分子質(zhì)量分布范圍很寬,表明其相對(duì)分子質(zhì)量分布不均一。AEPH和 ATPH2O的相對(duì)分子質(zhì)量分布比較均一,幾乎為單一峰。AEPH的峰高處相對(duì)分子質(zhì)量最大,為 2.47×105。AEPH-H2O的峰高處相對(duì)分子質(zhì)量為 0.85×105。AEPH和AEPH-H2O的相對(duì)分子質(zhì)量分別為 3.81 ×105和 2.40×105。

圖 1顯示,富含戊聚糖的AEPH組分洗脫時(shí)間早,表明具有較高的相對(duì)分子質(zhì)量。WEPH和AEPH -H2O的洗脫時(shí)間均較晚,為低相對(duì)分子質(zhì)量洗脫峰。由于WEPH和AEPH-H2O主要由β-葡聚糖組成,因此,可得出結(jié)論,黑小麥麩中戊聚糖的相對(duì)分子質(zhì)量高于β-葡聚糖。

2.5 紅外光譜分析

圖2為 3個(gè)多糖組分的紅外光譜圖。紅外光譜圖顯示,多糖組分在 500～4 000 cm-1范圍具有糖類的特征吸收峰。3 600～2 400 cm-1出現(xiàn)的寬峰是分子內(nèi)或分子間O-H伸縮振動(dòng)的結(jié)果。2 929 cm-1(3 000～2 800 cm-1)的吸收峰由 C– H(CH、CH2和 CH3)伸縮振動(dòng)引起,這個(gè)吸收峰常常被O– H伸縮振動(dòng)引起的寬峰所掩蓋。1 460～1 370 cm-1附近的吸收峰屬C-H的彎曲振動(dòng)。1 652 cm-1的強(qiáng)吸收峰是糖的水化物樣品的吸收峰。指紋區(qū)(1 300～1 000 cm-1)的吸收峰是由C-O伸縮振動(dòng)所引起的,歸屬于不同糖殘基糖環(huán)上的C-O-H和不同的糖苷鍵C-O-C。由單糖組成可知,WEPH和AEPH-H2O主要由β-葡聚糖組成,其紅外光譜中指紋區(qū)的吸收特征幾乎相同,而富含戊聚糖的AEPH在指紋區(qū)的吸收特征則有明顯不同。由于 923 cm-1有一吸收鋒,833 cm-1附近有微弱吸收峰,說明多糖分子以β-糖苷鍵為主,并含有一定量的α-糖苷鍵。

圖2 不同多糖組分的紅外光譜

3 結(jié)論

高壓輔助水提組分WEPH主要由葡萄糖(Glc)、阿拉伯糖 (Ara)和木糖 (Xyl)組成,是β-葡聚糖(73%)和戊聚糖(27%)的混合物;Ba(OH)2堿提組分AEPH主要由阿拉伯糖(Ara)和木糖(Xyl)組成,含有較純的戊聚糖(96%),其Ara/Xyl比值為0.60;堿后水提組分AEPH-H2O的 85%由葡萄糖(Glc)和半乳糖(Man)組成,主要為β-葡聚糖和阿拉伯半乳聚糖,以及少量戊聚糖。堿提多糖組分的Ara/Xyl比值,即Ara的取代度均高于水提多糖組分。富含戊聚糖的AEPH組分相對(duì)分子質(zhì)量最高,為 3.81×105,而以β-葡聚糖為主的WEPH和AEPH-H2O組分的相對(duì)分子質(zhì)量較低,其中單一峰組分AEPH-H2O為 2.40×105。

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Preparation and Analysis of Polysaccharides from Black-GrainWheatBran

Sun Yuanlin1Shan Fang2Liu Huifang3Zhang Junming1
(Department ofLife Science,YunchengUniversity1,Yuncheng 044000)
(Institute of Fa rm Products Comprehensive Utilization,ShanxiAcademy ofAgricultural Sciences2,Taiyuan 030031)
(Research and Development Center of Hedong Rye3,Yuncheng 044000)

Polysaccharide from black-grain wheat bran was prepared and characterization.Water soluble and water nonsoluble polysaccharideswere obtained by sequentially extracting black-grain wheat branwith water assisted by high pressure,saturated barium hydroxid,or distilled water as extraction medium respectively.Physicochemical propertieswere analyzed using instruments GC,HPLC,and IR.Results:The fractions extracted with water assisted by high pressure(WEPH)are composed of glucose,arabinose,and xylose,which was the mixture ofβ-glucan (73%)and pentosan(27%).The fractions extracted with saturated barium hydroxid(AEPH)aremainly composed of arabinose and xylose;the Ara/Xyl value is 0.60,indicating relative pure pentosan.The fractions extracted with distilled water(AEPH-H2O)are composed of glucose and galactose,mainlyβ-glucan,arabino-galactan and minor part of pentosan.AEPH,which is rich in pentosan,has a highMw of 3.81×105,whereasWEPH and AEPH -H2O have relative low Mw,theMw ofAEPH-H2O is 2.40×105.

black-grain wheat bran,polysaccharide,extraction,pentosan,β-glucan

S38 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1003-0174(2010)06-0094-04

山西省青年科研基金資助項(xiàng)目(2007021042)

2009-07-14

孫元琳,女,1971年出生,副教授,博士,天然產(chǎn)物功能因子