嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶的基因表達調控機制分析

陳士華吳興泉張 慧曹 健

(河南工業大學1，鄭州 450001)

(中原工學院2，鄭州 450007)

嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶的基因表達調控機制分析

陳士華1吳興泉1張 慧1曹 健2

(河南工業大學1，鄭州 450001)

(中原工學院2，鄭州 450007)

對嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶基因的啟動子區進行了定位，證明該基因為單順反子結構。分析該酶的代謝途徑證明亞油酸異構酶單獨處于一條分支途徑，無其他的酶與之協同作用。分析四種乳酸菌亞油酸異構酶基因的上游調控區，發現了12個保守位點，可能在亞油酸誘導基因表達調控中起重要作用。確定該蛋白N端無信號肽存在，但在N端25(27)～42位存在跨膜區，取向略微傾向于由外向內。證明嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶的密碼子偏好性與大腸桿菌的存在一定差異，可能影響亞油酸異構酶基因的表達，并提出了改造方案。

嗜酸乳桿菌 亞油酸異構酶 基因表達 機制

亞油酸異構酶可催化亞油酸轉化為共軛亞油酸(Coniugated linoleic acid，CLA)，而共軛亞油酸是近年來新發現的一種功能性脂肪酸，是具有共軛雙鍵的十八碳二烯酸的統稱。研究表明，CLA具有諸多的生理功能，如抗癌、抗動脈粥樣硬化、抑制脂肪積累、促進生長、激活免疫等。目前，利用化學異構法制備可食用的達到營養要求的共軛亞油酸產品很困難，且成本高、價格昂貴，而利用生物技術方法(即利用亞油酸異構酶轉化法)生產CLA產品完全可以克服這些缺點，且生產出的共軛亞油酸組成單一，能夠達到食品級保健食品的要求［1－5］。

亞油酸異構酶可將雙鍵在C－9和C－12位上的亞油酸(Linoleic Acid，LA)特異的轉化為雙鍵在C－10和C－12或C－9和C－11位上的共軛亞油酸［6］。Lin等［7］對嗜酸乳桿菌、保加利亞乳桿菌、德氏乳酸乳桿菌、乳酸乳球菌、嗜熱鏈球菌等菌株所產亞油酸異構酶的研究證明:嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶轉化LA為CLA的產率最高，因此，嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶引起了很多學者的關注。目前，關于嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶的發酵生產、分離純化、酶學特性等方面已取得了豐富的研究成果［8］。亞油酸異構酶的基因已被克隆［9］，并證明該酶基因的表達受亞油酸的誘導，表達效率較低，但其原因尚未探明，而且關于該酶基因的表達調控機理的研究報導極少，為此開展了本項目研究。

1 分析方法

1.1 乳酸菌亞油酸異構酶基因轉錄區的定位及序列分析

利用已克隆的嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶基因序列，采用http://www.ncbi.nlm.nih.gov網Blast工具檢索獲得嗜酸乳桿菌全基因組序列及該基因的位置。然后確定該基因上、下游序列，利用NNPP軟件分析啟動子位置。采用同樣方法獲得羅伊氏乳桿菌、植物乳桿菌、瘡疤丙酸桿菌的亞油酸異構酶基因上游調控區，通過Clustal軟件對四種乳酸菌亞油酸異構酶基因上游調控區進行序列比對分析。

1.2 信號肽與跨膜結構分析

采用SignalP軟件對嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶蛋白質序列中信號肽的位置及切割位點進行預測，選擇ExPASy Proteomics tools中的TMpred工具，預測其跨膜區段及取向。

1.3 密碼子偏好性分析

通過密碼子偏好性分析繪圖網站http://gcua.schoedl.de/index.html中的each codon vs.usage table功能網頁進行，輸入嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶的基因序列后，選擇大腸桿菌(Escherichia coli)為宿主表達系統，提交獲得該基因和大腸桿菌密碼子偏好性的對比結果。

1.4 嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶代謝途徑分析

在KEGG主頁(http://www.genome.jp/kegg/)上方的搜索欄中輸入嗜酸桿菌亞油酸異構酶的國際酶學編號EC5.2.1.5后，獲得該酶的信息列表，并進行整理分析。

2 結果與分析

2.1 嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶基因組定位

利用已克隆基因序列檢索Genbank獲得嗜酸乳桿菌全基因組序列(NC 006814.2)，在該基因組中，亞油酸異構酶結構基因序列位于634 806～636 581 bp間。該基因組公布時，未明確其具體功能，但發現其編碼蛋白具有肌凝蛋白交叉反應抗原(myosincrossreactive antigen)特征，因此命名為 myosincrossreactive antigen基因。

2.2 嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶基因轉錄區特征分析

2.2.1 嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶基因轉錄區的定位

分析發現在嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶基因與其上、下游基因間存在非編碼區，而該基因下游轉錄區的讀碼方向與該基因相反，因此可確定該基因獨享一個基因轉錄區，為單順反子結構。一般原核基因中功能相關的基因會以多順反子的形式存在于一個轉錄區內，共同表達完成一個特定的功能，類似亞油酸異構酶基因的單順反子結構在原核生物中較少見。

2.2.2 嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶基因轉錄啟動子的定位

嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶基因上游106 bp的非編碼區序列為Atttatttagcaaaattggttaatttcttgcatatagaaagcgctttttttacaataagaatatgtaatataaaactatacttatacaggaaaagaggacatcttt。利用NNPP軟件分析證明該序列中可能成為啟動子的序列可能有三段(表1)。

表1 NNPP軟件預測啟動子序列

其中，第3段位于42～87 bp間，得分為滿分1，在三段中其得分最大，即成為啟動子的可能性最大。分析發現該序列區49～54 bp間的tttaca序列符合－35區特征，間隔22 bp后出現的tatact序列符合－10區結構特征，原核生物的轉錄起始位點多為A，分析發現在－10區下游第9個核苷酸恰好為A，應為轉錄起始位點。由上述分析可以確定42 bp至87 bp間應為亞油酸異構酶基因的啟動子。進一步分析發現，在轉錄起始位點下游第2至第7個核苷酸為aagagg，該序列位于轉錄啟動位點和基因起始密碼子atg間，符合原核生物SD序列特征，該區在基因翻譯中可與核糖體小亞基相互識別定位。

該啟動子主要元件如圖1所示:

圖1 NNPP軟件預測啟動子序列

利用Blast軟件在Genbank中尋找與上述106 bp的非編碼區序列具有較高相似性的DNA序列，搜索得到多條相似序列，其中除本研究中的來自嗜酸乳桿菌的DNA序列外，其他相似序列均來自“斑變形蟲、果蠅、馬魚、小鼠、人類”等真核生物，可以匹配的相似序列的長度也較短(小于28 bp)。由此可見，在原核生物中該啟動子序列未見報導，說明關于該基因的表達特性目前尚無研究。

2.3 四種乳酸菌亞油酸異構酶基因上游序列對比分析

采用2.1中的方法對嗜酸乳桿菌、羅伊氏乳桿菌、植物乳桿菌和瘡皰丙酸桿菌的亞油酸異構酶的基因進行了基因組定位，明確各菌株亞油酸異構酶基因上游區序列。嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶基因上游區序列為:atttatttagcaaaattggttaatttcttgcatatagaaagcgctttttttacaataagaatatgtaatataaaactatacttatacaggaaaagaggacatcttt;羅伊氏乳桿菌亞油酸異構酶基因上游區序列為:ttttatccttcctcatatcaatattactcaactaattataagcgtttttgttaaattctaaaccattattttatttcccgggaaatcatctcgagaaagcgctacaatataactgtagattacccgattgcttttcctgaaaggagatcctttt;植物乳桿菌亞油酸異構酶基因上游區序列為:tttgaacggttagttaaaataaaaagtgagccgtctgcatttgtcaaggctcgctttttgcatacataaatggcagaacttgtggtgggaatgagccgcttgaaaaaatgtaatatttgttaaaggcaatgtgtttaattggagaaaagtcatcaaatggtgttacgctatgggcagaaattggttgactagcgcaaatattaagaaagcggcaagaaaacaaaaaagttcagttcaaactagacaatcactatccaagttgtataatgtacttgtaagcgttatcagaacctaattacct -att;瘡皰丙酸桿菌亞油酸異構酶基因上游區序列為: gatctttcgcgacctagaccattaccgaccccattcatcgccga-acttattcaccactacatcgacaaggaagaacg。運用Clustal X軟件進行完全比對，結果表明:以嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶基因上游調控序列為基準，在序列的第15 bp(A)，20 bp(T)，28 bp(T)，49 bp(T)，58 bp(A)，63 bp(A)，73 bp(A)，75 bp(A)，87 bp(C)，90 bp(G)，92 bp(A)，93 bp(A)等處存在四種酸乳菌共有的保守位點，可能在亞油酸誘導該基因表達調控中起重要作用。

2.4 蛋白質表達后的細胞定位分析

利用SignalP－NN軟件對該蛋白質信號肽序列進行了分析，結果表明該蛋白質N端存在酶切位點的可能性較低，可以確定該蛋白N端無信號肽存在。(原文中此處的文字刪去)

圖2 TMpred跨膜結構預測結果

選擇ExPASy Proteomics tools中的TMpred工具，輸入嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶蛋白質序列，預測其跨膜區段及取向。該軟件預測結果得分在500以上的才視為顯著，結果如圖2所示。預測結果顯示該酶蛋白可能存在的跨膜區段有2個:1個由內向外(即C端在膜外)的跨膜區，位于27～42位(得分1 409);1個由外向內(即N端在膜外)的跨膜區，位置在25～42位(得分1 565)。綜合分析其跨膜拓撲模型是:位置在25(或27)～42位間，共18(16)個氨基酸的跨膜區，取向略微傾向于為由外向內，屬于膜蛋白。

2.5 密碼子偏好性分析

利用密碼子偏好性分析繪圖網站，對嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶在大腸桿菌宿主系統中表達的密碼子偏好性作對比分析。結果發現嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶基因中有以下兩個密碼子AAG(編碼Lys)和CTT(編碼Leu)的使用情況可能會影響產物的表達，如果把AAG定點突變為AAA，CTT突變為CTG則該基因在大腸桿菌中成功表達的可能性較大。

2.6 嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶代謝途徑分析

在KEGG網站(http://www.genome.jp/kegg/)中查詢可獲得嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶的催化反應類型、底物、產物等相關信息。查看該酶所在的代謝途徑(圖3)可知，嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶(EC5.2.1.5)單獨處于一條分支途徑上，能獨立的催化亞油酸轉化為順－9，反－11－共軛亞油酸，上下游沒有其他的酶與之協同作用。

圖3 亞油酸代謝途徑

3 討論與結論

對嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶基因的啟動子區進行了定位，證明該基因為單順反子結構。分析該酶的代謝途徑證明亞油酸異構酶單獨處于一條分支途徑上，無其它的酶與之協同作用，這就將嗜酸乳桿菌亞油酸異構酶基因少見的單順反子結構與該酶能獨立催化異構反應的功能聯系起來。采用了將基因組信息和蛋白質在代謝網絡中的功能聯合分析的方法，研究了酶的性質功能和表達調控機制，也為相關研究提供了一條具有參考價值的思路。另外，分析發現四種乳酸菌亞油酸異構酶基因的上游調控區共同存在12個保守位點，可能在亞油酸誘導基因表達調控中起重要作用。

［1］Pawdi PW.Conjugated linoleic acid and other minogenic agents of Bovine milk［J］.Journal of Dairy Science，1999，82 (6):1339－1349

［2］Park Y，Ha YL，Pariza MW.pi－Complex formation of conjugated linoleic acid with iron［J］.Food Chemistry，2007，100 (3):972－976

［3］Park Y，Pariza MW.Mechanisms of body fat modulation by conjugated linoleic acid(CLA)［J］.Food Research International，2007，40:311－323

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［5］Cook ME，Miller CC，Park Y，et a1.Immunemodulation by altered nutrient metabolism:Nutritional control of inmmne－induced growth［J］.Poultry Science，1993，72:1301－1305

［6］Jun O，Kenji M.Conjugated linoleic acid accumulation via 10－hydroxy－12－octadecaenoic acid during microaerobic transformation of linoleic acid by lactobacillus acidophilus［J］.Applied and Environmental Microbiology，2001，67:1246－1252

［7］Lin TY，Lin CW，Lee CH.Conjugated linoleic acid concentration as affected by lactic cultures and added linoleic acid［J］.Journal of Food Chemistry，1999，67:1－5

［8］張琳.嗜酸乳桿菌共軛亞油酸異構酶的純化與生物信息學分析［D］.鄭州:河南工業大學，2007

［9］張鎮.亞油酸異構酶基因的克隆、表達及其功能鑒定［D］.北京:中國農業大學，2006.

Analysis of Expression Regulation Mechanism of Linoleic Acid Isomerase Gene of Lactobacillus acidophilus

Chen Shihua1Wu Xingquan1Zhang Hui Cao Jian2
(Henan University of Technology1，Zhengzhou 450052)
(Zhongyuan University of Technology2，Zhengzhou 450007)

The location of linoleic acid isomerase gene and it's promoter in the genome of lactobacillus acidophilus were confirmed，and it was found that the gene structure is monocistron.The linoleic acid isomerase was detected to be in a branched metabolic pathway alone without any enzyme in the upstream or downstream.Four regulation regions upstream of the linoleic acid isomerase genes of four kinds of Lactobacillus were analyzed and 12 conserved sites were found which maybe regulate the gene expression induced by linoleic acid.Results show that there is no signal peptide in the protein，but there is a transmembrane domain with orientation slightly preferred to be from outside to inside.The codon bias of Lactobacillus acidophilus was compared with that of Escherichia coli.Results reveal the difference of the codon bias between the two bacteria would affect the gene expression in Escherichia coli probably，and a plan for improvement is proposed.

lactobacillus acidophilus，linoleic acid isomerase，gene expression，mechanism

Q71 文獻標識碼:A 文章編號:1003－0174(2010)11－0062－04

河南省高校杰出科研人才創新工程項目(2006KYCX-008)

2009－11－02

陳士華，女，1972年出生，副教授，分子生物學與生物信息學

曹健，女，1969年出生，教授，微生物學