一株拮抗儲糧真菌的細菌菌株鑒定和初步研究

代巖石吳子丹伍松陵王松雪宋 慧孫長坡

(吉林農業大學生命科學學院1,吉林 130118)

(國家糧食局科學研究院2,北京 100037)

一株拮抗儲糧真菌的細菌菌株鑒定和初步研究

代巖石1,2吳子丹2伍松陵2王松雪2宋 慧1孫長坡2

(吉林農業大學生命科學學院1,吉林 130118)

(國家糧食局科學研究院2,北京 100037)

在糧庫倉儲玉米中分離到一株強烈拮抗儲糧真菌的細菌,初步研究表明該菌株對儲糧中的主要產毒真菌如黃曲霉菌、赭曲霉菌、三線鐮刀菌等都具有強烈的拮抗作用。利用生理、生化等常規技術并結合16S rDNA分子鑒定方法,最終確定該菌株為一株解淀粉芽孢桿菌,命名為 Bacillus amyloliquefaciens ASAG1。進一步確定了ASAG1菌株的搖瓶發酵最適培養基、發酵條件,并對發酵液中,活性抑菌物質的性質進行了初步研究和純化。該研究的開展為進一步明確活性抑菌組分提供了借鑒,同時也為利用生物技術防控糧食中的產毒真菌提供了一個新思路。

儲糧 產毒真菌 拮抗 解淀粉芽孢桿菌 活性物質

谷物是人們攝取營養、賴以生存的能量來源,是平衡膳食金字塔中比例最大、最為重要的物質基礎[1]。因發霉、害蟲危害導致的儲糧品質劣變和損失嚴重危害著我國儲糧安全。據聯合國糧農組織(FAO)統計,每年約有 25%糧食因真菌毒素污染影響食用[2-3]。目前發現危害糧食儲藏的真菌有 150多種,并可產生 200多種真菌毒素[4]。人體攝入這些毒素之后能夠導致嘔吐、消化系統和神經系統癥狀、多種原發性癌癥、甚至急性中毒死亡等等[4]。因此防止糧食霉變是保持糧食品質的重要方法之一。

目前所用的防霉方法主要是通過降低儲藏水分、溫度等物理作用處理糧食及其制品以防止霉菌生長,或通過添加化學防霉劑的方法控制儲糧及糧食產品霉變[5-6]。但是這些方法具有破壞營養、效果持續時間短、防霉不徹底和成本高等缺陷,從而造成實際防控效果不理想,另外有些化學防霉劑,本身具有一定毒性,使用不當反而會影響食用安全和污染環境。而利用一些有著抗真菌作用又對人體無害的微生物防霉則有成本低、增值快、作用效果持久、安全高效、綠色環保等優點。因此研究、開發生物防霉和利用微生物及其代謝產物防霉等技術,是提高防霉效率、減少營養損失、降低儲存成本的好方法。另外某些微生物的代謝過程還可以降解糧食和飼料中的不容易被機體消化吸收的大分子,使其降解成可以被機體直接吸收利用的小分子,從而在提高糧食利用率的同時,并提升了產品價值。

本研究對從儲糧中分離得到的一株拮抗產毒真菌的解淀粉芽孢桿菌進行了菌株鑒定,并初步驗證該菌株具有較好拮抗產毒真菌作用和使用安全性。同時對該菌株的培養條件以及抑菌譜進行了研究。在初步分析抑菌活性物質特點的前提下,從發酵液中粗提濃縮了抑菌活性物質。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

從儲備糧庫的玉米中分離篩選到具有強烈抑制真菌作用的一株細菌,并經純化、培養作為本研究目的菌株。本研究中用于作為指示菌及抗菌譜研究的儲糧主要有害真菌有黑曲霉菌 (Aspergillus.nigerCG2 MCC3.4463)、黃曲霉菌 (Aspergillus.flavusCG MCC 3.4410)、赭曲霉菌 (Aspergillus.ochraceusCG MCC 3.4520)、灰綠曲霉菌 (Aspergillus.glaucusCG MCC 3.3980)、煙曲霉菌 (Aspergillus.fum igatusCG MCC 3.3552)、赤 曲 霉 菌 (Aspergillus. ruberCG MCC 3.3956)、黃綠青霉菌 (Penicillium.citreo-virideCG M2 CC3.4038)、疣孢青霉菌 (Penicillium.verruculosum CG MCC3.4297)、半裸鐮刀菌 (Fusarium.sem itectum CG MCC3.0719)、尖孢鐮刀菌 (Fusarium.oxysporumCG MCC3.2830)、三線鐮刀菌 (Fusarium.tricinetum CG MCC3.4731),其中黃曲霉菌、赭曲霉菌、三線鐮刀菌為產毒株,均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心;炭黑曲霉菌 (Aspergillus.carbonarius),由中國農業大學梁志宏老師贈予;蘇云金芽孢桿菌 (B acillus. thuringiensisHD73)、蠟樣芽孢桿菌 (B acillus.cereus 14579)、蠟樣芽孢桿菌 (B acillus.cereus10987)、枯草芽孢桿菌 (B acillus.Subtilis168)由中國農業科學院植物保護研究所惠贈。

1.1.2 培養基

用于搖瓶發酵的 4號液體培養基,做抗菌譜試驗的 4號固體培養基,做抑菌試驗用培養基有 PDA (馬鈴薯葡萄糖培養基)、察氏培養基、高鹽察氏培養基和濃糖察氏培養基。

1.1.3 試驗主要儀器

溫度梯度 PCR儀:AB I公司;恒溫混勻器:eppen2 dorf公司;5810R離心機:eppendorf公司;自動高壓滅菌器:H IRAYAMA公司;全溫振蕩培養箱:河北太倉科學儀器有限公司;IX71顯微鏡:奧林巴斯公司。

1.1.4 試驗主要試劑與耗材

無菌微孔濾膜(濾徑為 0.2μm,除菌用):PALL公司;核酸回收試劑盒:大連 TaKaRa公司;血瓊脂培養基:友康基業生物科技 (北京)有限公司;生化試劑:主要購置于 Sigma公司、北京鼎國昌盛生物技術有限公司;其他化學試劑(均為分析純):北京奧博星生物技術公司和北京化學試劑廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離

①把糧庫的儲藏玉米 25 g加入到 225 mL無菌水中,振蕩搖洗 30 min,樣液做梯度稀釋到 103～104倍,接 PDA培養基,其配方為:馬鈴薯 200 g/L、葡萄糖 20 g/L、瓊脂 20 g/L,自然 pH,48 h開始觀察,每天 1次共觀察 7 d。②觀察發現培養皿中有拮抗真菌的菌落,挑取該菌落,以劃線方式接 PDA培養基, 48 h后觀察。③挑取形態不同的各個菌落在 PDA培養基上與不同的儲糧有害真菌做對峙試驗。④挑選有較強拮抗現象的菌落,重復步驟②,若平皿上只生長一種菌落,重復步驟③,有拮抗現象,則該拮抗菌株被分離純化成功。若平皿上生長有多種菌落,則反復重復步驟③、④直至拮抗菌株被分離純化出來。若單一菌落對真菌無拮抗作用則需返回步驟③,重復以上各步驟,直至拮抗菌株被分離純化。

1.2.2 菌株對產毒真菌的拮抗作用初步驗證

將黃曲霉菌、赭曲霉菌、三線鐮刀菌接入到1 000 g經輻照滅菌的高水份玉米中,28℃、相對濕度70%培養 90 d,分別取 25 g樣品,粉碎后檢測黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素、玉米赤霉烯酮。黃曲霉毒素B1檢測方法參照 GB/T 5009.22—2008、赭曲霉毒素檢測方法參照 GB/T 5009.96—2008、玉米赤霉烯酮檢測方法參照 GB/T 5009.209—2008。用以上經驗證產毒的黃曲霉菌、赭曲霉菌、三線鐮刀菌分別與篩選出來的有拮抗作用的菌株做對峙試驗,以測定其對產毒真菌的拮抗作用。

1.2.3 菌株的鑒定

①革蘭氏染色;②芽孢染色;③分解淀粉試驗:將該菌株與對照菌枯草芽孢桿菌一起接在加入 2%可溶性淀粉的 PDA培養基上,31℃培養 48 h后在培養基表面均勻滴加 1%碘酒精溶液,再放入培養箱, 30 min后觀察;④測定該菌株生長情況,檢測在 600 nm波長的吸光值,繪制菌株生長曲線,觀察產生芽孢情況;⑤16S r DNA鑒定:選擇對數生長期的菌液作為提取樣本,提取基因組DNA,對 16S rDNA目的片斷 PCR進行擴增[7]。

引物序列:

Bs16sR:5′-TGGAGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′

Bs16sF:5′-AAG GAG GTGATC CAG CCG CAC CT-3′

PCR反應體系 (50μL):純水 30μL,10×buffer 5μL,dNTP4μL,lmol/L的MgCl2 3μL,上下游引物各1μL,模板DNA 4μL,Taq DNA聚合酶 1μL。

PCR反應條件:①94℃預變性 5 min;②94℃變性 30 s、57℃退火 40 s、72℃延伸 90 s,31個循環;③72℃延伸 10 min。PCR產物回收插入 PMD-18T載體后由上海生工進行序列測定。

序列輸入 GenBank數據庫中進行比對,選擇同源性高的序列使用 Clustal W→TreeView軟件構建系統發育樹[8]。

1.2.4 菌株安全性初步評價

以產生外毒素的蠟樣芽孢桿菌 14579、蠟樣芽孢桿菌 10987、蘇云金芽孢桿菌為對照,將目的菌株與三種對照菌株接在血瓊脂培養基上,31℃培養 48 h觀察溶血現象[9]。

1.2.5 培養基篩選

中所用的 4種用于目的芽孢桿菌培養的培養基分別命名為 1號培養基[10],2號培養基[11],3號培養基[12],4號培養基[13]。經以上 4種培養基發酵后的除菌發酵液用牛津杯定量法比較抑菌效果,從中選出一種最適培養基。同時,從儲糧主要有害真菌中篩選出一種被抑制作用明顯、對人體危害小、生長快速、便于觀察的菌株作為抑制試驗指示菌。

1.2.6 培養條件優化

以選定的培養基為基礎,搖床培養,200 r/min。時間條件優化:比較培養 8、12、16、24、30、36、48、60、72、96 h的發酵液抑菌作用。pH條件優化:調整培養基 pH值,分別為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0培養72 h后比較抑菌作用。溫度條件優化:比較 25、27、29、31、33、35、37℃培養 72 h的發酵液抑菌作用。

1.2.7 菌株抑菌譜試驗

采用對峙試驗方法[14],ASAG1菌株與 12種常見儲糧有害真菌在 4號培養基上做對峙試驗。

1.2.8 除菌發酵液抑菌試驗

將ASAG1菌株發酵液以 12 000 r/min離心 10 min,上清液用 0.2μm無菌微孔濾膜過濾除菌后,采用牛津杯定量法[15]做抑制試驗,測量抑菌圈直徑大小,以確定該菌株對 12種常見儲糧有害真菌的抑菌效果。其中黑曲霉菌、黃曲霉菌、煙曲霉菌、炭黑曲霉菌、疣孢青霉菌、赭曲霉菌、黃綠青霉菌使用察氏培養基,三線鐮刀菌、半裸鐮刀菌、尖孢鐮刀菌使用PDA培養基,灰綠曲霉菌使用高鹽察氏培養基,赤曲霉菌使用濃糖察氏培養基做抑菌試驗。

表1 培養基配方/g/L

1.2.9 活性抑菌物質性質初步研究

以培養 72 h的發酵液為基礎。①用 1 mol/L鹽酸和 1 mol/L氫氧化鈉調整發酵液 pH值分別為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0,觀察發酵液有無沉淀及比較各 pH值時發酵液的抑菌作用。②發酵液以不同溫度、持續時間加熱,比較經 70℃300 min、100℃15 min、100℃30 min、100℃60 min、100℃120 min、121℃20 min處理后的發酵液抑菌作用。③將 1 mL發酵液與乙醇、甲醇、丙酮、乙腈、異丙醇、二氯甲烷等常用有機溶劑等體積混合后密閉放置 24 h,氮吹,除去有機溶劑,用純水定容至 1 mL,做抑菌試驗比較其抑菌作用。

1.2.10 活性物質的初步提取

利用發酵液在不同pH值時產生沉淀的性質,用 1 mol/L氫氧化鈉調整發酵液 pH值至11.0,5 000 r/min離心5min,去除沉淀,再用1mol/L鹽酸調pH值至3. 0,12 000 r/min離心 10 min,棄掉上清液,沉淀加少量純水,再調 pH值到 7.0溶解,再加純水定容為原體積的 1/100,再取 100倍濃縮粗提液 100μL加純水定容至10 mL,混勻,與發酵液原液做等量抑菌試驗,比較二者活性大小。

2 結果與分析

2.1 菌株分離

在 PDA培養基上挑選有強烈拮抗儲糧真菌作用的菌株,經反復純化培養及拮抗作用測試,篩選出一株細菌,命名為ASAG1菌株。ASAG1菌株為革蘭氏陽性短桿菌。芽孢染色鏡檢如圖 1所示,可產生大量芽孢。

圖 1 B.amyloliquefaciensASAG1菌株芽孢染色鏡相

2.2 菌株鑒定

分解淀粉試驗結果如圖2所示,可以看出,該菌的分解淀粉能力要比對照菌(枯草芽孢桿菌)強得多。

圖 2 B.amyloliquefaciensASAG1菌株分解淀粉試驗

2.3 16S rDNA序列測定及分析

由圖3可以看出,菌株ASAG1的16S r DNA核苷酸片段大小為 1.5 Kb左右,測定結果為 1 468 bp。將上述序列輸入 www.NCB I.Nih.nih.gov./blast.與Genbank數據庫的序列比進行同源性分析,并利用Clusta X軟件構建系統發育樹,如圖 4。

綜合以上分析可將該菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌 (B acillus am yloliquefaciens)。并將該菌的 16S r D2 NA序列提交到 NCB I Genbank中登錄注冊,序列接受號為:FJ597542。

2.4 外毒素產生分析

安全性初步評價試驗中,如圖 5所示,可以看出,三株對照菌蠟樣芽孢桿菌 14579、蠟樣芽孢桿菌10987、蘇云金芽孢桿菌菌落周圍均有明顯的溶血環,而ASAG1菌株則無溶血現象。因此,初步驗證了ASAG1菌株不產外毒素,使用安全。

圖 5 B.amyloliquefaciensASAG1菌株產外毒素測定結果

2.5 儲糧真菌產生真菌毒素的鑒定及 ASAG1菌株對真菌的拮抗效果

將ASAG1菌株與在糧食中生長、經檢驗產毒(如圖 6至圖 8所示)的黃曲霉菌、赭曲霉菌、三線鐮刀菌做對峙試驗,結果如圖 9所示,其對這三株產毒真菌有明顯的拮抗作用。

2.6 培養基篩選與培養條件優化

試驗過程中發現,活性物質對黑曲霉菌的抑制作用明顯,且黑曲霉菌對人體相對安全、容易操作、生長速度快、24～48 h就可以觀察結果,適合作為試驗指示菌使用,以下的試驗將以此為基礎展開。

ASAG1菌株在四種培養基中經搖床培養 200 r/ min,31℃,72 h后,除菌發酵液對黑曲霉菌的抑制作用在圖 10中可以看出,4號培養基的抑制作用最明顯,抑菌圈直徑最大為 23 mm,3號培養基的抑菌圈為16 mm,2號培養基的抑菌圈為 10 mm,1號培養基的抑菌圈為 8 mm。因此選擇 4號培養基作為ASAG1菌株產生抑菌活性物質的最適培養基。試驗結果說明,糊精、葡萄糖、蔗糖、乳糖這 4種碳源中,以乳糖作為碳源最有利于 ASAG1菌株發酵產生抑菌活性物質,牛肉膏、胰蛋白胨、蛋白胨中,以蛋白胨作為氮源最有利于 ASAG1菌株發酵產生抑菌活性物質。無機氮源中,硝酸鈉效果要好于硫酸銨。4號培養基配方為:馬鈴薯 100 g/L、乳糖 40 g/L、蛋白胨15 g/L、硝酸鈉 0.5 g/L、7水合硫酸鎂 4 g/L,pH值7.0(4號培養基加入 20 g/L瓊脂即為 4號固體培養基)。

圖 10 B.amyloliquefaciensASAG1菌株在 4種不同培養基中產生活性物質的能力

ASAG1菌株搖瓶培養,24 h開始有抑菌活性物質產生,隨時間延長,抑菌活性物質的含量逐漸增加,如表 2所示,到 48 h抑菌圈直徑達到 22 mm,之后抑菌圈直徑沒有明顯增大。培養基的 pH值在5.0～11.0之間,均可以產生活性物質,但與 pH值7.0時的抑菌圈相比較小,如表 3所示,這表明, ASAG1菌株產生的活性抑菌物質的 pH值適應范圍較寬,最適 pH值為 7.0。ASAG1菌株在不同溫度下培養產生的活性物質的量差異不大,如表 4所示, 31℃培養時抑菌圈的直徑最大為 23 mm,25℃和37℃培養時抑菌圈直徑分別為20 mm和 21 mm。這說明ASAG1菌株適應溫度范圍較寬。因此,培養基pH值 7.0,31℃,培養 48～72 h,是ASAG1菌株的最佳培養條件。

表2 培養時間對抑菌活性物質產生的影響

表3 培養基pH值對抑菌活性物質產生的影響

表4 培養溫度抑菌活性物質產生的影響

2.7 菌株與除菌發酵液抑菌效果

ASAG1菌株與 12種常見儲糧有害真菌,在 4號固體培養基上做對峙試驗,結果表明:ASAG1菌株對黑曲霉菌、黃曲霉菌、煙曲霉菌、三線鐮刀菌、炭黑曲霉菌、疣孢青霉菌、赭曲霉菌、半裸鐮刀菌、尖孢鐮刀菌有明顯的拮抗作用。而黃綠青霉菌、灰綠曲霉菌、赤曲霉菌在 4號固體培養基上不能生長,無法觀察拮抗作用。

牛津杯定量法對除菌發酵液的抑菌試驗結果,如表 5所示,ASAG1菌株發酵液對以上 12種真菌都有明顯的抑制作用。

表5 除菌發酵液對 12種儲糧有害真菌抑制作用

2.8 活性物質的性質探索與初步提取

向ASAG1菌株發酵液中加鹽酸調 pH值到 5.1時,發酵液開始產生沉淀,上清液有活性;繼續加鹽酸,pH值到 4.0時,上清液活性消失,當發酵液 pH值為 3.0時,沉淀量最大。加氫氧化鈉溶液調發酵液 pH值到 9.1時,發酵液開始產生沉淀,上清液有活性;繼續加氫氧化鈉,pH值為 11.2時,沉淀最多,上清液有活性,pH值超過 12.0以后活性快速下降,直至消失。圖 11所示為不同 pH值時,上清液抑菌直徑的變化。

圖11 pH值對抑菌物質活性的影響

發酵液中抑菌活性物質受溫度影響非常小,在100℃以內長時間加熱對活性幾乎沒有影響,120℃時對活性有較小的影響,這說明該菌產生的活性物質具有很好的高溫穩定性。

常用有機溶劑對發酵液抑菌活性無影響。

2.9 活性物質粗提

根據發酵液在不同 pH值時表現出來的性質,調整 pH值,去除無活性沉淀和上清液,回收有活性沉淀,最后得到濃縮粗提液。由于最后定容使用純水溶解沉淀,所以,原來培養基中的鹽和雜質也基本上除去。定容為原體積的 1/100,得到 100倍的濃縮粗提液。采用此種方法得到的粗提液 100倍稀釋后做抑菌試驗,抑菌圈直徑為 20 mm,與原液相比較活性損失不明顯,這說明活性物質在整個處理過程中沒有大量損失和發生性質、結構改變。

3 討論與結論

在本研究中,一株從儲糧中分離得到的解淀粉芽孢桿菌ASAG1,經初步驗證對儲糧中的主要產毒真菌,黃曲霉菌、赭曲霉菌、三線鐮刀菌都有很好的拮抗作用,這說明其生長過程或者代謝產物對以上三種真菌有抑制作用。之后的安全性試驗中, ASAG1菌株不產生對人體、動物有害的細菌外毒素,初步鑒定了其使用安全性。在以上兩個試驗結果的基礎之上,進一步對 ASAG1菌株的培養條件、抑菌活性以及活性物質的粗提展開了細致的研究。

通過優化 ASAG1菌株培養條件的研究發現, ASAG1菌株在較寬的溫度、pH值范圍內都可以產生大量的抑菌活性物質,這說明該菌株適應自然環境能力強。另外,ASAG1菌株對儲糧有害真菌的強烈抑制作用,保證了該菌株在儲糧及糧食制品防霉方面將有很好的應用效果。

在ASAG1菌株的抑菌活性研究中,采用對峙試驗證明,ASAG1菌株在生長過程中對黑曲霉菌、黃曲霉菌等多種可以產生真菌毒素的儲糧真菌均具有很好的抑制作用。這說明ASAG1菌株具有寬廣的抗菌譜。本研究結果還表明,ASAG1菌株能產生的抑菌活性物質,并且活性物質可分泌到菌體外部,并溶解在培養基中,有利于提取純化。

研究表明,酸堿作用可以使ASAG1菌株發酵液中活性物質沉淀或溶解,調整 pH值到 7.0左右時活性仍可恢復。利用這一特性調整 pH值,可得到去除大部分雜質和鹽的濃縮活性物質組份。在試驗中,活性物質還表現出耐高溫、與常用有機溶劑混合后性質不發生變化等特點。在下一步對活性組份分離純化的試驗中,我們就可以利用活性物質耐有機溶劑的性質,使用有機溶劑萃取、樹脂吸附、液相色譜等方法純化、制備活性組分;再利用活性物質耐高溫的性質,使用旋轉蒸發、真空濃縮等方法進一步提純活性組分。

隨著傳統農藥、殺蟲劑對環境破壞問題日益被人們關注[16]和植物病原菌耐藥性增強,導致藥效相對降低等原因凸顯[17],利用生物技術防治作物病害、殺蟲,成為研究熱點。自 1945年 Johnson等人發現枯草芽孢桿菌能夠產生抗菌物質以來[18],芽孢桿菌因其內生芽孢、繁殖能力強、有利于工業化生產、又是自然界廣泛純在的非致病菌等諸多優點,被科研工作者熱切關注[19]。近些年,解淀粉芽孢桿菌的抗菌作用逐漸被人們發現和認識。從已發表的文獻中看,研究人員在解淀粉芽孢桿菌的代謝產物中發現至少兩種以上抗菌活性物質[20],并且其抗菌活性非常強,性質穩定,不易失活,表現出很好的研究前景。

志謝:本課題研究過程中受到中國農業大學梁志宏老師、中國農業科學院植物保護研究所等大力的支持和指導,并提出了寶貴的建議,在此表示衷心感謝!

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Identification of a Bacterium Strain with Antagonistic Action to Toxigenic Fungi in Stored Grain

Dai Yanshi1,2Wu Zidan2Wu Songling2Wang Songxue2Song Hui1Sun Changpo2
(Jilin AgriculturalUniversity1,Jilin 130118)
(Academy of State Administration of Grain2,Beijing 100037)

A bacterium strain was isolated from stored corn,which has strong antagonistic action to principal toxigenic fungi such asA.flavus,A.ochraceus,F.tricinetum,etc in stored grain.This bacterial strain was identi2 fied asBacillus amyloliquefaciens by using conventional techniques of physiology and biochemistry combined with the 16SrRNA molecular identification method,nominated Academy of State Administration of Grain 1 and abbreviated ASAG1.The optimum medium and conditions for shaking fermentation ofASAG1 bacterial strain were further deter2 mined,and the nature of the bioactive antagonistic substance in the fer mented liquid were preliminary studied and purified.This study provides a clear reference for further studying the antagonistic components,and provides a new consideration for biological control of toxigenic fungi in stored grain.

stored grain,toxigenic fungi,antagonistic,Bacillus amyloliquefaciens,active substance

Q939.92 文獻標識碼:A 文章編號:1003-0174(2010)10-0088-07

國家“十一五”科技支撐計劃(2009BADA0B05)

2009-10-10

代巖石,男,1979年出生,碩士,生物化學與分子生物學

孫長坡,男,1975年出生,博士,副研究員,生物工程