高山被孢霉Δ6-脂肪酸脫氫酶基因轉化大豆的研究

王廣科,李明春,李晉川,潘渠,何思思,刑來君

(1.成都醫學院病原生物學教研室,四川 成都 610083;2.南開大學微生物學系,天津 300071)

·論著·

高山被孢霉Δ6-脂肪酸脫氫酶基因轉化大豆的研究

王廣科1,李明春2,李晉川1,潘渠1,何思思1,刑來君2

(1.成都醫學院病原生物學教研室,四川 成都 610083;2.南開大學微生物學系,天津 300071)

目的 從高山被孢霉中克隆的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因與植物表達載體 pBA121連接,構建重組質粒pBMACL6,采用農桿菌介導的大豆子葉節轉化系統成功地將該基因導入到栽培大豆吉林 47品種中,獲得一批轉基因植株。方法 利用子葉節外植體誘導出叢生芽和再生植株,利用卡那霉素的抗性篩選培養基連續篩選以及 PCR方法、DNA分子雜交分析檢測轉基因植株中的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因表達狀況。結果 經 PCR檢測和DNA分子雜交分析,初步證明Δ6-脂肪酸脫氫酶基因已導入并整合到大豆基因組中。結論 成功地將Δ6-脂肪酸脫氫酶基因導入并整合到大豆基因組中。

Δ6-脂肪酸脫氫酶基因;大豆;農桿菌介導轉化;轉基因植株

脂肪酸脫氫酶 (fatty acid desaturase)是不飽和脂肪酸合成途徑的關鍵酶之一,能催化脂肪酸長鏈的特定位置上脫氫形成雙鍵。在動物、植物和微生物等的膜脂中含有特定的不飽和脂肪酸,其不飽和程度由催化不同脫飽和反應的脫氫酶所調節[1]。因此,脂肪酸脫氫酶在生物膜的形成和物理性質、調節膜脂中脂肪酸的組成與不飽和度等方面起著決定性的作用[2-5]。

大豆中富含亞油酸,它可以作為Δ6-脂肪酸脫氫酶作用的底物催化生成γ-亞麻酸 (GLA)。本室對不同來源的 20多種大豆的脂肪酸成分的分析表明：亞油酸含量占脂肪酸總量的 40%以上,最高達58.3%.現在,國內外報道的轉基因大豆成功的例子很多,如抗除草劑、抗蟲以及抗真菌等,轉化方法也比較成熟。本室從高產γ-亞麻酸的高山被孢霉菌株中克隆出Δ6-脂肪酸脫氫酶的結構基因,是世界上第10個克隆出該基因的實驗室,在 GenBank中的序列接收號分別為AF307940,并在酵母和煙草中得到表達[6-9],為將該基因轉化到大豆中提供了前提和基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物材料 吉林 47優良品種,由吉林省農科院大豆研究所提供。

1.1.2 菌株與質粒 M ortierella alpinaATCC 16266,本室保存Agrobacterium tum efaciensLBA4404,由中科院微生物所方榮祥院士饋贈 pGA643 (Kanr),由內蒙古大學哈斯阿古拉教授惠贈 pTMACL6(Ampr)(全長MA D6D cDNA),南開大學真菌實驗室保存。

1.1.3 主要試劑 UN IQ-10柱式多用途DNA純化試劑盒,dNTPMix,上游引物9651,下游引物w21500均購自上海 Sangon公司;限制性內切酶,T4DNA連接酶,卡那霉素,利福平和鏈霉素等主要購自華美生物工程公司,寶生物公司;地高辛標記和檢測試劑盒購自德國 Roche公司;Taq DNA聚合酶,Taq DNA plus購自鼎國生物技術有限公司;γ-亞麻酸標準品購自 Sigma公司;其余試劑均為國產分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基的配制 LB、YEB培養基見《分子克隆實驗指南》;MS及MSB配方見《分子克隆實驗指南》。

1.2.2 抗生素與激素的配制 配制方法見《分子克隆實驗指南》。

1.2.3 植物表達載體的構建 以重組質粒pT MACL-6進行 PCR,PCR的產物純化后經 XbaⅠ和BglⅡ雙酶切獲得高山被孢霉的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因,經與 pGA643質粒載體連接構建出含有Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的 pG MACL-6表達載體。將該表達載體經電轉化到LBA4404根癌農桿菌中,并以此菌進行東北大豆品種吉林 47的轉化實驗。

1.2.4 農桿菌的培養 從保存的農桿菌平板上挑取含有表達載體的單菌落接入含有 50 mg/L Kan、25 mg/L Rif、25 mg/L Str的 YEB培養基中,28℃, 150 r/min振蕩培養。

1.2.5 農桿菌介導Δ6-脂肪酸脫氫酶基因轉化大豆。

1.2.6 轉基因植株的分子生物學檢測

轉基因植株 PCR檢測 取卡那霉素篩選過的轉基因植株,用 CTAB法提取總DNA,用于 PCR擴增Δ6-脂肪酸脫氫酶基因。

上游引物序列 P1(9651)：5’-GGCTTCTAGAATGGCTGCTGCTCCCAGT-3’(XbaⅠ)下游引物序列 P2 (w21500)：5’-CTGCAGATCTTTACTGCGCCTTACC-3’(BglⅡ)反應條件：94℃5 min→94℃1 min→53℃1 min→72℃2 min→35 cycles→72℃10 min.

轉基因植株的 Southern檢測 大量提取 PCR反應陽性大豆轉基因植株的總 DNA,HindⅢ單酶切后經過電泳及轉膜步驟后與地高辛標記的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的探針雜交,具體步驟見雜交試劑盒說明書。

2 結果

2.1 質粒DNA鑒定

對重組表達載體 pGAM I CL6進行 XbaⅠ和 BglⅡ雙酶切鑒定,可見一條約 1.37 kb的電泳帶 (Δ6-脂肪酸脫氫酶基因約為 1.37 kb),說明目的基因存在,結果見圖 1.

圖1 重組表達載體pGMACL6酶切鑒定Fig.1 Restriction analysis of recomb inant expression vectors pGAM I CL6/MACL61.pG M ICL6/XbaⅠ+BglⅡ;2.pGA643/XbaⅠ+BglⅡ;3.λDNA/ HindⅢMarker;4.D6D PCR product

2.2 農桿菌的轉化與鑒定

采用液氮凍融法將構建好的植物表達載體pGAMACL6轉化到農桿菌 LBA4404,然后再含有125 mg/LStr、25 mg/Lrif和 100 mg/Lkan的 YEB選擇培養基上,28℃培養 48 h后出現白色菌落。采用菌落 PCR法鑒定農桿菌的轉化子。電泳檢測表明它們的 PCR產物大小一致,均為 1.37 kb,從而可以證明本試驗構建的植物表達載體 pGAMACL6已轉入農桿菌中。PCR檢測結果如圖 2.

圖2 PCR鑒定農桿菌中的D6D基因Fig.2 Identification of D6D genes in Agrobacterium tumefaciens by PCR1.pG M ICL6;2 DL2000 Marker;3 pG MACL6.

2.3 農桿菌介導的大豆子葉節遺傳轉化

在子葉節外植體獲得后,轉移到預培養基中培養 24-36 h,然后進行農桿菌的感染。同時以未經預培養基培養和在預培養基培養 140 h的子葉節誘導從生芽進行比較可知：未經預培養基培養的子葉節要比經過預培養 24-36 h的子葉節推遲 3-5 d左右出現從生芽。將子葉節預培養 140 h,則子葉節誘導叢生芽率會急劇下降(如表 1)。原因可能是短時間的預培養有助于切口細胞進入傷口修復反應,產生一定數量的愈傷,而長時間的在誘導愈傷培養基上預培養,阻礙了細胞進一步分化生長,并加快了細胞的老化及褐化過程,因而使誘導叢生芽率不斷下降。

表1 預處理對大豆叢生芽誘導的影響Tab.1 The effect of pretreatment on induction of multiple shoot of soybean

2.4 轉基因植株的分子生物學檢測分析

2.4.1 轉基因植株的 PCR檢測 以 CTAB法提取大豆轉化抗性再生苗 (T0代)和 T1代葉片中的總DNA,以材料和方法中的 PCR反應條件進行擴增,電泳檢測。結果在 33棵吉林 47抗性再生植株中,擴增出了約 1.4 kb的目的帶,而未轉化的對照則無此目的帶,PCR陽性率為 65.12%.實際轉化率為 1. 03%.見圖 3.

2.4.2 轉基因植株的斑點雜交分析 提取 PCR檢測陽性的轉基因植株葉片的總DNA,與Δ6-脂肪酸脫氫酶基因探針進行斑點雜交檢測,結果 PCR表現陽性的樣品,在斑點雜交中均表現為陽性,雜交斑點清晰,見圖 4.

3 討論

3.1 影響農桿菌介導大豆遺傳轉化率的因子

3.1.1 無菌苗的培養時間 無菌苗的培養時間對于大豆子葉節的遺傳轉化也有很大影響。本實驗分別采用培養 2天、4天、6天和 8天的無菌苗作為實驗材料,切除其子葉節外植體經農桿菌感染后誘導轉化芽,結果發現從培養 4天的無菌苗上切除的子葉節外植體轉化芽誘導率較高,這和構建再生體系時的結論一致。選擇 5天以上苗齡的子葉節表現為：抗性再生苗少,再生苗 PCR陽性率較低,即獲得的抗性植株嵌合體較多,可能是以這些苗齡的子葉節為外植體轉化時,側芽開始生長,而使再分化芽生長受到抑制,如將已長出的側芽切掉,切口處則生成愈傷組織,但誘導叢生芽困難。

3.1.2 農桿菌菌株 農桿菌轉化能力與農桿菌菌

株[10]有關。王連錚等利用致癌農桿菌的 15個菌系對 2759個大豆品種的致癌作用進行了研究,篩選出7個致瘤能力較強的菌系,致瘤效果較好的菌株為B3/73、C58、A208.李洪泉等用根癌農桿菌 chry5對我國 10個大豆栽培品種子葉的致瘤作用進行了研究,結果對 7個品種上致瘤率作用比我國的超毒菌株A281還強,對所有品種的致瘤率高于 T37,說明不同農桿菌菌株轉化能力差異很大。本實驗采用根癌農桿菌LBA4404,該菌株廣泛應用于大豆的遺傳轉化中。根癌農桿菌通常用 YEB培養液活化后,再感染外植體。農桿菌活化時間以及感染時農桿菌的菌農對轉化率都有一定的影響,一般而言,農桿菌在活化 30小時左右為最佳感染時間,此時農桿菌的感染能力最強。

3.1.3 感染時間 本實驗主要采用浸泡的方法來感染外植體,實驗結果表明：感染時間以 15～20分鐘為宜,時間較短會使轉化率降低,而時間過長會使外植體易黃化或褐化,影響芽的誘導。另外,實驗還發現感染時人為制造傷口的轉化效果優于未造成傷口的轉化效果。

3.1.4 酚類化合物 AS 酚類化合物乙酰丁香酮(AS)等對農桿菌轉化能力有明顯影響。國外 Annette等報道乙酰丁香酮利于提高大豆的轉化效率,國內許躍和李寶鍵實驗也證明,多酚化合物或用對農桿菌敏感的植物提取物處理農桿菌,誘導 Vir區基因活化,增加農桿菌在培養植物細胞上的附著[11,12]。本實驗也表明：農桿菌感染后共培養時加入 100 suM/L的乙酰丁香酮對農桿菌轉化能力有明顯的提高,促進根癌農桿菌對外植體的高效轉化。

3.2 影響抗性再生苗生根的因子

3.2.1 轉化苗的生長情況 轉化苗在加有 GA3的伸長培養基中培養一段時間后轉移到生根培養基中,實驗表明,當轉化苗在伸長培養基中長到3～4 cm長時轉到生根培養基中最利于生根。過矮會使抗性苗在生根培養基中生長緩慢,以造成抗性苗的矮化;過高會使抗性苗易老化,在生根之前就死亡。

3.2.2 抗生素及激素 本實驗的生根培養基中已去除了抑制細菌的頭孢霉素,抗性壓力也有所緩解,卡那霉素由分化培養基中的50 mg/L降為25 mg/L.對于激素而言,不加 6-芐氨基嘌呤 (6-BA),3-吲哚丁酸( IBA)由 0.2 mg/L升高到 1.5 mg/L.

3.2.3 蛭石和生根粉 抗性再生苗在生根培養基中長出主根后,轉入蛭石中。由于蛭石良好的透氣性,有利于主根的生長和大量側根的形成。另外,使用生根粉利于根的生長。

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The Study on Transformation ofΔ6-Fatty Acid Desaturase Genes fromM ortierella alpine into Soybean

WANG Guang-ke1,LIM ing-chun2,LI Jin-chuan1,PAN Qu1,HE Si-si1,XING Lai-jun2.
(1.Chengdu M edical College,Chengdu,Sichuan610083,China;2.Depar tm ent of M icrobiology,Nankai University,Tianjin 300071,China)

Objective To introduceΔ6-fatty acid desaturase genes fromM ortieralla alpinainto jilin47 via Agrobacterium infection method,adentitious,and obtain transgenic plants.M ethods Adentitious buds and regenerated plants were induced from cotyledon nodes and screened continuously in kanamycin resistant culture medium.PCR and Southern blot were used to detect expression of theΔ6-fatty acid desaturase genes in transgenic plants.Results PCR and Southern blot analysis from transgenic plantsproved that theΔ6-fatty acid desaturase geneswere transferred and integrated into soybean genome.Conclusion TheΔ6-fatty acid desaturase genes are transferred and integrated into soybean genome successfully.

Δ6-fatty acid desaturase gene;Soybean(Glycin max L);Agrobacterium-mediated transforma tion;transgenic plant

Q943.2;Q949.751.9

A

1674-2257(2010)02-093-04

10.3969/j.issn.1674-2257.2010.02.001

2010-03-03

2010-03-13

國家自然科學基金資助項目(編號：30200176)

王廣科(1976-),男,安徽省淮北市人,博士,主要從事腫瘤治療和愛滋病毒疫苗的研究,電話：13668172093