替米沙坦對糖尿病大鼠腎臟表達ICAM-1和VCAM-1的影響

徐艷梅，許傳文

（湖北省武漢市普愛醫院，腎內科 湖北 武漢 430030）

糖尿病腎病 (diabetic nephropathy DN)是糖尿病最為嚴重的慢性微血管并發癥之一，嚴重影響患者的生活質量并威脅患者的生命，但其發病機制尚未完全清楚。近期研究及臨床資料提示，細胞間黏附分子（intercellular adhesion molecular-1，ICAM-1）和血管細胞黏附分子（vascular cell adhesion molecular-1，VCAM-1）介導的炎癥反應參與了糖尿病腎病的發生與發展，能增加尿蛋白、促進細胞外基質的沉積、引起腎小球纖維化[1，2]。有學者觀察，血管緊張素受體Ⅱ(AngⅡ)拮抗劑（英文全名，ARB）可以通過抑制黏附分子合成而減輕腎小球炎癥[3]。本文對鏈脲佐菌素（英文全名，STZ）誘導的糖尿病大鼠給予替米沙坦治療，觀察了替米沙坦對糖尿病大鼠腎小球ICAM-1、VCAM-1表達的影響，旨在從黏附分子角度探討替米沙坦對糖尿病腎病的保護機制。

1 材料

1.1 儀器與試劑

全自動生化分析儀（美國Beckman公司，CX5CE）；HIMAS-2000圖像分析系統（湖北千屏影像有限公司）；STZ（美國 Sigma公司,批號：BF1003）；替米沙坦（德國勃林格殷格翰制藥有限公司）；SP試劑盒（北京中山公司,）；山羊抗大鼠ICAM-1和山羊抗大鼠VCAM-1抗體（Santa Cruz公司）；Trizol試劑盒（美國GIBCO公司）；

1.2 動物

健康 SD大鼠 18只，雄性，體重（180±20）g（華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供）。

2 方法

2.1 動物模型的建立與分組

健康雄性SD大鼠，于左腎切除后一周，開始禁食10 h。然后，單次腹腔注射50 mg/kg STZ，用0.1 mol/L無菌檸檬酸緩沖液配制，pH4.5）。72 h后取尾靜脈血測血糖，尿糖試紙測尿糖。血糖≥16.7 mmol/L，尿糖（3+～4+）者選入糖尿病大鼠模型[2]。正常對照組僅注射等量的檸檬酸緩沖液。糖尿病大鼠隨機分成DM組（糖尿病組）6只；R組（替米沙坦治療組）6只；C組（正常對照組）6只。R組以替米沙坦5 mg/kg·d靜脈給藥；C組和DM組每天同體積生理鹽水灌胃。所有大鼠在整個灌胃期間均喂標準飲食，不得使用胰島素。12周后處死動物并收集3 mL下腔靜脈血及處死前24 h尿，留取右側腎臟并稱重。部分腎組織以10%甲醛固定，其余組織置于-80℃冰箱中凍存。

2.2 生化檢查

留24 h尿檢測尿蛋白定量。血標本檢測血糖、血肌酐。并計算腎重與體重之比。

2.3 腎組織病理學檢查

腎小球PAS染色及病理程度分析：常規固定、包埋、3μm切片PAS染色。高倍鏡下順序觀察，每張切片觀察5個腎小球，每組觀察5張切片，用HIMAS-2000圖像分析系統定量測量每個腎小球的面積（GA），腎小球內細胞外基質面積（ECM）。結果用ECM/GA表示，即代表腎小球增生程度。

2.4 免疫組化檢測

采用SP法進行染色分析。腎臟標本固定，石蠟包埋切片，分別按試劑盒說明進行ICAM-1和VCAM-1染色。再由兩位免疫病理人員對染色標本進行評定，同時觀察陽性細胞在腎小球內的分布。然后，利用HIMAS-2000病理圖像分析系統，測定ICAM-1和VCAM-1陽性著色的平均灰度×面積比。由此對ICAM-1和VCAM-1進行半定量分析。

2.5 腎組織總蛋白提取和Western-blot檢測

稱取100 mg腎組織，剪碎，1 mL蛋白裂解液[50 mM Tris（pH7.5），150mM NaCl，5 mM MgCl2，5 mM EDTA，0.5%NP40，1 mM PMSF，20μg/mL Aprotintin]中勻漿，考馬司亮藍G250測蛋白濃度。取腎組織蛋白100μg經10%的SDS-PAGE凝膠電泳后，轉移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液4℃封閉，再加入山羊抗大鼠ICAM-1和山羊抗大鼠VCAM-1抗體4℃過夜后，用AP標記的兔抗山羊IgG進行雜交，洗膜后進行NBT/BCIP顯色。雜交結果MGIAS-1000凝膠成像分析系統測量吸光度值。

2.6 統計學分析

利用SPSS13.0軟件進行統計學分析。計量數據用均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05表示具有統計學意義。

3 結果

3.1 生化、腎重及病理改變

與C組相比，DM組及R組大鼠血糖、蛋白尿定量、血清肌酐均顯著性升高（P＜0.01）；與DM組相比，R組大鼠蛋白尿定量與血清肌酐顯著性降低（P＜0.01），血糖無明顯變化；與C組相比，DM組大鼠腎臟重量增大，R組腎重小于DM組并大于C組，但無顯著性意義。詳見表1。大鼠腎組織光鏡下可見DM組及R組腎小球部分體積增大，系膜區有不同程度增生，間質可見中性粒及單核淋巴細胞浸潤，C組未見明顯異常。詳見圖1。

3.2 免疫組化

與C組相比，DM組及R組ICAM-1和VCAM-1表達增加（P＜0.01），但R組ICAM-1表達顯著低于DM組（P＜0.01）,R組VCAM-1表達顯著低于DM組（P＜0.01）。詳見表2、圖2。

表1 各組大鼠血，尿生化結果 （±s）

表1 各組大鼠血，尿生化結果 （±s）

注：1）與 C組相比，P ＜0.05；2）與 C組相比，P ＜0.01；3）與 DM組相比，P ＜0.05；4）與 DM組相比，P ＜0.01

組別 鼠數 血糖（mmol/L） 尿蛋白（mg/d） 血清肌酐（μmol/L） ECG/GA 腎重/體重(×10-3)C組 6 6.46±0.79 10.50±2.48 58.69±12.63 0.21±0.03 4.70±0.67 DM組 6 21.38±2.372） 49.03±11.372） 122.12±18.632） 0.53±0.042） 8.82±0.852）R 組 6 20.50±1.732） 32.21±3.72）3） 79.09±12.391）4） 0.33±0.031）4） 7.86±1.002）

圖1 腎臟病理圖片

表2 各組大鼠ICAM-1、VCAM-1免疫組化結果

3.3 ICAM-1和VCAM-1蛋白表達

DM組及R組ICAM-1和VCAM-1蛋白表達變化趨勢與免疫組化表達相一致，見表3、圖3。

表3 各組大鼠ICAM-1、VCAM-1的Western印跡結果

圖2 免疫組化圖片

圖3 免疫印跡圖片

4 討論

本實驗使用雄性SD大鼠單腎切除一次性腹腔注射STZ進行造模，結果造模12周后，尿蛋白的排泄率、腎重/體重比值、血清肌酐增加，光鏡下可見腎臟細胞外基質積聚，基底膜增厚，表明模型成功，與文獻[4]基本一致，大鼠尚處于糖尿病腎病早期。

本實驗結果表明，模型組大鼠腎臟肥大，尿蛋白的排泄增加，細胞外基質增生積聚，基底膜增厚，腎組織ICAM-1和VCAM-1表達增加。替米沙坦可使實驗性糖尿病大鼠腎組織病變減輕，顯著減少尿蛋白，并可以抑制腎組織ICAM-1和VCAM-1表達。

糖尿病腎病時白細胞在腎小球和腎間質的浸潤是糖尿病腎病組織的特征性表現之一，并在腎小球硬化方面起重要作用。SUGIMOTO[5]第一次提出，在糖尿病大鼠早期腎臟，ICAM-1表達明顯增加而且伴有大量白細胞、巨噬細胞浸潤，并認為腎臟高濾過可能是其主要原因。為了進一步證實兩者之間的聯系，已有大量的試驗證實，用抗ICAM-1的單克隆抗體阻斷ICAM-1/LFA-1作用可以防治T1DM。近年來OKADA[6]發現，轉基因ICAM-1-/-的小鼠經STZ誘導成模后，與ICAM-1+/+的小鼠相比，大大降低了血肌酐、尿素氮以及腎小球硬化指數等，進而明顯延緩了糖尿病腎病的發展。MA[7]等甚至通過實驗發現了ICAM-1參與糖尿病腎病發生、發展的基因片段。另外，王小丹等[8]發現，在伴有腎臟病變的2型糖尿病患者血液內，VCAM-1水平明顯要比沒有這些病變患者的高，可以假設VCAM-1參與了糖尿病并發癥的發展。同時RUBIO-GUERRA等[9]也發現，2型糖尿病患者血循環VCAM-1水平與患者蛋白尿成正比例關系。由此可見，ICAM-1和VCAM-1是糖尿病腎病發展的重要環節。

本實驗發現，ICAM-1和VCAM-1在正常對照組只有很少量的表達，而糖尿病組和糖尿病治療組表達明顯增強，表明其可能在高糖狀態下被激活，這與ALTANNAVCH等[10]研究結果相一致。ICAM-1和VCAM-1屬于免疫球蛋白超家族的成員，可介導內皮細胞與單核/巨噬細胞和淋巴細胞的黏附，從而有助于這些炎癥細胞游走到腎小球，導致一系列的細胞因子產生。單核/巨噬細胞和淋巴細胞浸潤是糖尿病腎小球病變的特征之一，可能在糖尿病腎病腎小球肥大、細胞外基質增多，毛細血管基底膜增厚、蛋白尿的發生和發展方面發揮重要作用[11]。本研究通過免疫組化和Western印跡分析方法發現，DM組大鼠ICAM-1和VCAM-1的蛋白表達增強，進一步證實了ICAM-1和VCAM-1在糖尿病腎病發展中的作用。

有研究證實，腎素-血管緊張素系統參與了糖尿病腎病的進展，其中AngⅡ起重要作用[12-13]。糖尿病時高血糖使腎素-血管緊張素系統活性增高，尤其是腎組織中AngⅡ含量增加，導致血管通透性增加，炎癥細胞浸潤[14]。LIU[15]等證明，AngⅡ通過增強氧化酶活性介導ICAM-1表達、白細胞浸潤、血管壁增厚。替米沙坦作為半衰期最長的受體拮抗劑，能夠持久平穩地抑制AngⅡ，從而減少炎癥因子的表達、腎小球系膜炎癥細胞的浸潤[16]。

替米沙坦是一種高活性高選擇性的血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）受體拮抗劑，AngⅡ通過與血管、腎臟、心臟、腎上腺上的AT1受體結合發揮其作用。本實驗發現，替米沙坦治療后能顯著下調高表達的ICAM-1和VCAM-1，同時腎小球病理改變減輕，尿蛋白和血清肌酐明顯下降，從而提示替米沙坦可直接或間接通過降低ICAM-1和VCAM-1表達，改善糖尿病大鼠腎臟病變。然而，替米沙坦究竟是通過哪些環節影響ICAM-1和VCAM-1的表達，尚有待于進一步闡明。

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