海藻和海藻酸鈉中糖醛酸含量的測定

張文婧，李靜梅，吳 穎，梁 平，石 波，*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，北京100081；2.中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，北京100081；3.北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，北京100026）

海藻和海藻酸鈉中糖醛酸含量的測定

張文婧1，李靜梅2，吳 穎3，梁 平1，石 波1，*

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院飼料研究所，北京100081；2.中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所，北京100081；3.北京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所，北京100026）

利用陰離子交換樹脂對酸水解后的海藻酸鈉進行分離，得到D-甘露糖醛酸（M）和L-古洛糖醛酸（G），經(jīng)過高效液相色譜、電噴質(zhì)譜及核磁共振確定其純度和結(jié)構(gòu)。利用自制的M和G作為標準品繪制標準曲線，用外標法計算得到海藻酸鈉樣品中M含量為63.06%，G含量為11.48%；海藻樣品中M含量為21.65%，G含量為4.67%。該實驗為海藻膠及海藻寡糖中的D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸含量的測定奠定了一定的基礎。

D-甘露糖醛酸，L-古洛糖醛酸，高效液相色譜，檢測

海藻中的海藻酸是由D-甘露糖醛酸（D-Mannuronic Acid，簡稱 M）和 L-古洛糖醛酸（L-Guluronic Acid，簡稱G）組成的一種酸性多糖。其因主鏈上連接的M和G位置的不同而決定了其結(jié)構(gòu)的不同，理化性質(zhì)隨著M/G比例而改變，相應的M/G比例也決定了在食品、醫(yī)藥和紡織等方面的不同用途。Patrick等曾對已攝入Sr-85的動物飼喂M/G具有不同比值的海藻酸鈉進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當海藻酸鈉中G的含量增高時能有效地抑制Sr-85在動物體內(nèi)的吸收［1］。目前在工業(yè)上使用的是海藻酸的鈉鹽即海藻酸鈉。因此，快速、準確地測定出海藻和海藻酸鈉中M和G的含量具有極其重要的價值，其結(jié)構(gòu)見圖1。由于高純度的M和G單一組分規(guī)模化制備具有一定的難度，因此目前通常采用核磁共振（NMR）的方法測定海藻和海藻酸鈉中M和G的含量［2-3］，該方法需要核磁共振儀器和專業(yè)儀器操作人員，這極大地制約了對于褐藻和海藻酸以及鈉鹽的研究和應用。本研究首先以海藻酸鈉為原料，制備出高純度的D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸單一組分，然后選擇高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，簡稱HPLC）的方法，將所得到的M和G作為標準品，測定海藻和海藻酸鈉中兩種糖醛酸M和G的比值和含量，以實現(xiàn)海藻及海藻酸鈉中M和G含量的快速、準確測定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海藻 山東蓉城2007年產(chǎn)，粉碎機粉碎；海藻酸鈉、無水碳酸鈣、氫氧化鈉 國藥集團化學試劑公司，分析純；硫酸、鹽酸、冰醋酸 北京化工廠，分析純；1×8陰離子交換樹脂 美國Dowex，200目；重蒸水，蒸餾水。

圖1 D-甘露糖醛酸結(jié)構(gòu)和L-古洛糖醛酸結(jié)構(gòu)

Waters 2695高效液相色譜儀 附配有 Waters 2414示差檢測器，美國Waters公司；AR 2140分析天平 感量：0.0001g，美國奧豪斯公司；FD-1D真空冷凍干燥機 北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；RE-3000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；RVC 2-18旋轉(zhuǎn)真空離心濃縮儀 德國Christ；BSZ-30自動部分收集器 上海滬西分析儀器廠；IKA加熱磁力攪拌器德國IKA；APEXII型FT-ICR質(zhì)譜儀 美國Bruker Daltonic；Bruker ARX-400核磁共振儀 瑞士Bruker；常壓玻璃層析柱 Φ45×450mm，中國科學院過程研究所；Silica Gel F254硅膠板 MERCK；烘箱 350± 1℃，上海精宏實驗設備有限公司；FW100高速萬能粉碎機 24000r/min，天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：ZORBAX SAX 4.6× 250mm 5-Micron Agilent；柱溫：40℃；流動相：0.7mol/L乙酸；流速：1.0mL/min；測定波長：示差檢測；示差檢測器溫度：40℃；進樣量：10μL［4］。

1.2.2 D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸的制備 稱取海藻酸鈉5g，加入76%的硫酸50mL，常溫下攪拌反應2.5h，再加入650mL蒸餾水，沸水浴中水解3h，冷卻后加稍過量的無水CaCO3中和，抽濾，并用蒸餾水洗滌濾渣兩次，合并濾液，40℃下真空濃縮至體積為5mL，用0.1mol/L NaOH調(diào)pH為8.0，并保持0.5h不變。

取上述海藻酸鈉水解液上已轉(zhuǎn)為CH3COO-型的Dowex1×8陰離子交換樹脂柱，用0.5～2mol/L的乙酸溶液以2mL/min的速度進行梯度洗脫，用自動部分收集器收集，每瓶收集150mL，共收集60瓶。

在每個收集瓶中取20μL液體，按順序點于硅膠板上，晾干后噴5%硫酸乙醇顯色劑，并于110℃烘箱中烘5min。

按照薄層層析檢測結(jié)果，將相同組分的收集液合并，45℃真空濃縮后冷凍干燥，用HPLC分析其純度。并對其進行ESI-MS和1H NMR以及13C NMR測定，確定兩組分的化學結(jié)構(gòu)。

1.2.3 標準曲線的繪制 稱取制得G標準品，用重蒸水溶解，配制成濃度為 1.07、2.14、3.21、5.35、10.7mg/mL的標準溶液。稱取制得的M標準品，用重蒸水溶解，配制成濃度為1.2、6.0、12、24、30mg/mL的標準溶液。分別進樣10μL進行HPLC測定，以峰面積為縱坐標，相應標準溶液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線和進行線性回歸。

1.2.4 樣品處理及檢測 準確稱取300mg（精確至± 0.0001g）海藻酸鈉，加入72%硫酸溶液3.5mL，于研缽中研磨2h，用100mL蒸餾水將其轉(zhuǎn)移至250mL三角瓶中，100℃沸水浴加熱2.5h，于自來水中冷卻至室溫，加入過量BaCO3粉末，充分反應至溶液pH為7左右，3000r/min離心，沉淀用150mL蒸餾水洗滌3次，將上清液和洗滌液合并在一起，45℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮后，定容至10mL，進樣10μL進行HPLC測定。海藻樣品的處理方法同上，濃縮后定容至5mL，進樣10μL進行HPLC測定。依據(jù)樣品測定的峰面積和出峰時間，在相應的標準曲線查出所測組分的量，結(jié)合所取樣品的質(zhì)量和定容體積，計算出各組分的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸單一組分的分離純化

硫酸水解海藻酸鈉所得產(chǎn)物見圖2。由圖2可知，海藻酸鈉酸水解產(chǎn)物含有2個主要組分A和B，保留時間分別為6.993min和7.934min。

圖2 海藻酸鈉酸水解產(chǎn)物的HPLC譜圖

將海藻酸鈉酸水解產(chǎn)物經(jīng)Dowex1×8陰離子交換樹脂層析柱分離，所得每個收集瓶中收集液薄層層析顯色，結(jié)果（圖3）表明，含有糖的洗脫液均有斑點顯示，并可以看出共有3組斑點，其中第一組為中性糖［5］，第二組為組分A，第三組為組分B。

圖3 陰離子交換樹脂層析柱分離所得收集液的TLC結(jié)果

圖4和圖5分別為冷凍干燥得到的組分A和組分B的HPLC檢測譜圖。組分A的保留時間為7.008min，組分B的保留時間為10.557min。

圖4 組分A的HPLC譜圖

通過與圖2中保留時間的比較得知，組分A和B這兩種物質(zhì)在Dowex1×8陰離子交換樹脂為分離介質(zhì)、乙酸水溶液為洗脫液的層析柱中得到了有效地分離，且HPLC的分析純度（以峰面積百分比計）均達到99%以上。

圖5 組分B的HPLC譜圖

2.2 L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸化學結(jié)構(gòu)鑒定

將柱層析分離后所得的組分峰A和B分別收集，冷凍干燥后進行MS和1H NMR以及13C NMR檢測，確定其化學結(jié)構(gòu)。

組分峰A：1H-NMR（400MHz，D2O）：α體，δ= 4.96（1H，d，J=8.4Hz，H-1），3.99（1H，d，J=3.6Hz，H-2），4.01（1H，d，J=3.6Hz，H-3），4.10（1H，s，H-4），4.58（1H，s，H-5）；β體，δ=5.30（1H，d，J= 3.6HzH-1），3.70（1H，dd，J=8.4Hz，H-2），4.17（1H，d，J=4Hz，H-3），4.15（1H，d，J=3.6Hz，H-4），4.27（1H，s，H-5）。13C-NMR，（100MHz，D2O）：α體，δ=92.98（C-1），66.91（C-2），70.89（C-3），70.65（C-4），73.56（C-5），175.06（C-6）；β體，δ=93.65（C-1），68.60（C-2），71.10（C-3），70.76（C-4），73.56（C-5），174.08（C-6）。

ESIMS m/z 193［M］+（100），C6H10O7。根據(jù)以上實驗數(shù)據(jù)，確定組分峰A為L-古洛糖醛酸。

組分峰B：1H NMR，（400MHz，D2O）：α體，δ=5. 28（1H，d，J=2Hz，H-1），3.95（1H，d，J=4.4Hz，H-2），3.93（1H，d，J=1.6Hz，H-3），3.82（1H，s，H-4），4.26（1H，dd，J=5.4Hz，H-5）；β體，δ=4.98（1H，s，H-1），3.99（1H，d，J=3.2Hz，H-2），3.80（1H，s，H-3），3.73（1H，d，J=2Hz，H-4），3.67（1H，s，H-5）。13C-NMR，（100MHz，D2O）：α體，δ=93.85（C-1），68.28（C-2），70.27（C-3），70.07（C-4），72.42（C-5），175.05（C-6）；β體，δ=93.99（C-1），68.73（C-2），71.02（C-3），69.61（C-4），72.81（C-5），174.56（C-6）。

ESIMS m/z 193［M］+（100），C6H10O7。根據(jù)以上實驗數(shù)據(jù)，確定組分峰B為D-甘露糖醛酸。

2.3 海藻酸鈉中L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸含量的測定結(jié)果

根據(jù)圖6，以L-古洛糖醛酸峰面積（Y）對應質(zhì)量濃度（X，mg/mL）作回歸分析，得到回歸方程為y= 40396x-20326，R2=0.997。

根據(jù)圖7，以D-甘露糖醛酸峰面積（Y）對應質(zhì)量濃度（X，mg/mL）作回歸分析，得到回歸方程為：y=24689x-3244，R2=0.999。

由圖6和圖7的結(jié)果可以得出，在1.07～10.7mg/mL范圍內(nèi)，L-古洛糖醛酸具有良好的線性關系；在1.2～30mg/mL范圍內(nèi)，D-甘露糖醛酸具有良好的線性關系。

圖6 L-古洛糖醛酸標準曲線

圖7 D-甘露糖醛酸標準曲線

圖8 海藻酸鈉完全水解產(chǎn)物的HPLC譜圖

圖8為海藻酸鈉完全水解產(chǎn)物的HPLC譜圖。按照外標法計算樣品中D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸的含量分別為63.06%和11.48%，M/G=5.493。用HPLC檢測獲得的峰面積比值代表樣品中M和G的含量比，海藻酸鈉中的M/G=3.20，誤差較大。選擇D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸標準品，建立相應的標準曲線才能準確地測定出海藻酸鈉樣品中兩種糖醛酸的含量。

2.4 海藻中G和M含量測定結(jié)果

圖9為海藻中褐藻完全水解產(chǎn)物的HPLC譜圖，按照外標法計算褐藻樣品中D-甘露糖醛酸和L-古洛糖醛酸的含量分別為21.65%和4.67%，M/G= 4.636。而用HPLC檢測獲得的峰面積比值代表樣品中M和G的含量比，則褐藻中的M/G=2.819，與實際比值存在較大的誤差。

圖9 褐藻完全水解產(chǎn)物的HPLC譜圖

3 結(jié)論

選擇Dowex1×8強堿型陰離子交換樹脂為制備型常壓柱層析的分離介質(zhì)，乙酸水溶液為洗脫液，進行梯度洗脫，可以成功地從海藻酸鈉硫酸水解液中分離純化出L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸，兩組分純度分別達到99%以上。一次性上樣由5g海藻酸鈉制得的硫酸水解液，可獲得的L-古洛糖醛酸純品0.5839g，D-甘露糖醛酸純品1.7614g。采用本實驗制備的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸作為標準品，HPLC檢測，海藻酸鈉和褐藻中的L-古洛糖醛酸及D-甘露糖醛酸的含量分別為11.48%和63.06%以及4.67%和21.65%。本實驗為測定褐藻和海藻酸鈉中L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸的含量提供了一個方便、準確的方法。

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Quantitative determination of uronic acid in seaweeds and sodium alginate

ZHANG Wen-jing1，LI Jing-mei2，WU Ying3，LIANG Ping1，SHI Bo1，*
（1.Feed Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；2.Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China；3.Beijing Products Quality Supervision and Inspection Institute，Beijing 100026，China）

The column chromatography with anion-exchange resin was used for isolating mannuronic acid（M）and guluronic acid（G）from hydrolyzed alginate sodium，the collected components were analyzed by high performance liquid chromatography（HPLC），ESl-MS and NMR.M and G was used as a standard，external reference method was used for assay of M and G in brown algae and alginate sodium.The concentration of M in brown algae was 21.65%and G was 4.67%，also alginate sodium has 63.06%M and 11.48%G.The experiment built a new method for quantitating D-mannuronic acid and L-guluronic acid in sodium alginate and seaweed oligosaccharides.

D-mannuronic acid；L-guluronic acid；high performance liquid chromatography；detection

TS254.1

A

1002-0306（2010）12-0338-04

2010-04-08 *通訊聯(lián)系人

張文婧（1984-），女，碩士研究生，主要從事天然產(chǎn)物與糖工程在飼料添加劑方面的研究。

“十一五”國家海洋“863”課題（2007AA091601-2）。