利用乳清為主要原料高密度培養干酪乳桿菌

李 云，黃志丹，鄭麗芬，彭智鵬，葉曉靜

（韓山師范學院生物系，食品與發酵工程研究所，廣東潮州521041）

利用乳清為主要原料高密度培養干酪乳桿菌

李 云，黃志丹，鄭麗芬，彭智鵬，葉曉靜

（韓山師范學院生物系，食品與發酵工程研究所，廣東潮州521041）

利用乳清為原料高密度培養干酪乳桿菌（Lactobacillus casei STL3102），用于生產濃縮發酵劑。在5L發酵罐研究了pH控制和補料培養條件，結果表明，加堿控制pH對菌體生長有利，控制pH為6.0時的菌體干重最高。不同堿液對菌體的生長有顯著影響，流加NH3·H2O菌體的產量較高，24h時菌體干重達3.74g/L。在流加NH3·H2O，控制pH6.0條件下，對菌體補料發酵進行了研究。采用30g/L為初始乳清濃度，發酵16h以1.0mL/min恒速補料，發酵44h，菌體干重達4.79g/L，此時測定發酵液中活菌數為1.95×1011CFU/mL。

干酪乳桿菌，高密度培養，補料，乳清

濃縮型乳酸菌發酵劑具有發酵活力強，簡化生產工藝，防止菌種退化和污染，有利于保持產品質量的穩定等特點，已廣泛應用于乳酸菌發酵食品的生產。濃縮型發酵劑的制備需使乳酸菌達到高密度培養（high cell density culture，HCDC）。乳酸菌的高密度培養采用合成培養基［1-4］和乳基質培養基，合成培養基成分復雜、配制繁瑣，工業中生產乳品發酵劑多選用乳基質培養基，如全脂奶或脫脂乳粉培養基。乳清是工業生產干酪的副產品，主要含有乳糖和乳清蛋白等營養成分，適合乳酸菌生長，是工業化生產發酵菌劑較理想的原料［5-7］。本文在前期工作優化乳清增菌培養基的基礎上，進一步在5L發酵罐上，研究了pH控制和補料條件下干酪乳桿菌（Lactobacillus casei STL3102）的高密度培養，為進一步放大實驗和工業化生產乳酸菌劑提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei STL3102） 由韓山師范學院生物系食品發酵研究所保藏；MRS培養基［8］用于種子液和發酵培養；脫脂牛乳培養基10%脫脂乳粉溶于蒸餾水中，108℃滅菌15min，用于活化菌種；乳清培養基 乳清60g/L、牛肉膏8.44g/L、酵母粉8.85g/L、磷酸氫二鉀3.48g/L，pH7.0，用于發酵培養；D90脫鹽乳清粉 為荷蘭進口（乳糖含量82%）；酵母粉、胰蛋白胨、牛肉膏 購自廣州環凱公司；其他試劑 均為分析純。

2-16離心機 SIGMA；UV-2100分光光度計UNICO；PHS-3B型精密pH計 上海精密儀器設備公司；5BG 5L全自動發酵罐 上海保興生物設備公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養方法 菌種活化：取L.casei STL3102保藏菌種接種于脫脂牛乳培養基，35℃培養至凝乳，鏡檢合格后備用。種子培養：接種1～2環活化菌種于MRS培養基，250mL三角瓶裝液量50mL，35℃培養16h。發酵培養：將種子液以7%的接種量接入發酵培養基。5L發酵罐中裝液量為2.5L，攪拌轉速為200r/min，控制罐溫35℃，不通風厭氧發酵，通過自動流加堿液溶液控制發酵液的pH，通過蠕動泵采用恒速流加方式補料，補料液組成為乳清100g/L、牛肉膏8.44g/L、酵母粉8.85g/L、磷酸氫二鉀3.48g/L。

1.2.2 測定方法 菌體干重的測定：100mL的發酵液8000×g離心15min，收集菌體沉淀懸浮于10mL蒸餾水中洗滌，再次離心，-20℃預凍后，冷凍干燥至恒重，稱重。

殘糖測定：5mL的發酵液8000×g離心15min，取上清液適當稀釋后，采用鄰甲基苯胺法［9］測定乳糖含量。

滴定酸度測定：取5mL發酵上清液，參照GB/T 5009.46-2003方法測定滴定酸度（°T）。

活菌數測定：平板菌落計數法。菌液10倍梯度稀釋，選取適當稀釋度吸取1mL于無菌平皿中，然后倒入預冷至45℃以下的MRS固體培養基，混勻。35℃培養48h，菌落計數。

2 結果與分析

2.1 5L發酵罐分批培養

L.casei STL3102在5L發酵罐分批培養過程曲線如圖1所示，0～4h為遲滯期，此時菌體量無明顯增加。4～22h為對數生長期，菌體干重迅速上升，菌體大量產酸，導致pH迅速下降以及滴定酸度的增加。22h后進入穩定期。菌體干重在 22h達到最大1.79g/L，此時乳糖處于較高的濃度30.12g/L，pH為4.21，說明菌體生長停滯不是由于營養物的缺乏造成，而是菌體生長大量產酸抑制引起。

圖1 L.casei STL3102在5L發酵罐分批培養過程曲線

2.2 pH控制培養L.casei STL3102

2.2.1 不同pH控制條件對L.casei STL3102增殖的影響 根據分批培養的結果，補堿中和乳酸，降低產酸抑制，流加5mol/L NaOH溶液控制發酵液的pH，考察不同pH控制條件下菌體干重、乳糖濃度隨時間的變化。結果（圖2A）表明，加堿控制pH后，減弱了產酸對菌體生長的抑制，控制pH后的菌體干重均高于空白對照。不同pH的實驗組中，控制pH6.0時，菌體生長情況最好，培養22h時菌體干重達3.29g/L，比分批培養（1.79g/L）提高了83.80%。圖2B顯示，在不同pH控制條件下菌體消耗葡萄糖的趨勢基本相同，pH為6.0時乳糖消耗快，與此條件下菌體生長旺盛相對應，22h時菌體干重達最大時殘糖濃度為21.57g/L。

圖2 控制不同pH條件下菌體生長（A）、乳糖消耗（B）隨時間的變化過程

2.2.2 不同堿液對L.casei STL3102增殖的影響 控制pH為6.0，考察流加不同堿液對菌體干重和乳糖消耗的影響，結果如圖3所示。培養10h，不同堿對菌體生長影響差異不顯著。隨著培養時間增加，產酸不斷增加，不同堿液對菌體生長影響出現差異，14～20h，流加NaOH對菌體生長較好，24～28h，流加NH3·H2O組菌體干重顯著高于其余各組。24h時流加 NH3·H2O菌體干重達到最大 3.74g/L，而Na2CO3、KOH和NaOH的效果較接近。從不同堿液對乳糖消耗的影響圖可以看到，24h獲得最大菌體量時，流加NH3·H2O的殘余糖濃度（24.30g/L）高于其他堿液，說明其單位碳源菌體量得率較高。NH3· H2O不僅可以維持發酵液pH，而且可以作為氮源被菌體利用，這可能是NH3·H2O優于其他堿液的原因。通過使用28%NH3·H2O為中和劑，pH控制為6.0，培養24h時菌體干重達3.74g/L，比分批培養（1.79g/L）提高了108.9%。

圖3 不同堿液對菌體生長和乳糖消耗的影響

2.3 補料培養L.casei STL3102

由2.2中表明，采用流加NH3·H2O控制pH能夠提高菌體濃度，實驗中發現，菌體量達到最大時（24h），發酵液中殘余乳糖的濃度較高（24.30g/L）。此時由于產酸的影響，菌體生長基本停滯，殘余的乳糖無法被菌體利用造成原料的浪費。因此，可考慮采用較低初始乳清濃度發酵，中間補加營養物質，以提高原料的利用率。

2.3.1 不同初始乳清濃度對菌體增殖的影響 圖4顯示了采用NH3·H2O控制pH6.0時，不同初始乳清濃度條件下菌體干重、乳糖濃度隨時間的變化。結果表明，16h內30g/L初始乳清濃度菌體生長優于45g/L乳清，45g/L乳清濃度能使菌體在較長的時間保持生長并最終獲得較多生物量。較低的初始乳清濃度有利于菌體更快地適應環境，能較快地達到最大菌體量。以30g/L初始乳清濃度的培養過程，對數生長末期16h時菌體量達到最大（2.62g/L），此時殘余乳糖濃度較少（9.14g/L），16h后菌體的生長明顯變緩，低殘糖濃度對菌絲的生長產生限制作用。因此，通過設計中間補料的策略，維持發酵液中的糖的濃度，促進菌體保持較快生長。

圖4 不同初始乳清濃度條件下菌體生長（A）、乳糖消耗（B）隨時間的變化過程

2.3.2 不同補料速率對菌體增殖的影響 采用30g/L初始乳清濃度，流加NH3·H2O控制pH為6.0，發酵至16h時分別以0.5、1.0、1.5mL/min恒速補料，測定菌體干重、乳糖濃度隨時間的變化，結果如圖5所示。發酵16h時補料，維持發酵液中較高的乳糖濃度，使菌體延續較快地生長，隨著補料的進行，發酵液體積增加，在補料后期菌體濃度有所下降。與不補料相比，補料培養后菌體的生長時間延長，使菌體的最大干重增加。從不同補料速率的結果對比看，1mL/min補料速率較好，發酵 44h，菌體干重達4.79g/L，比分批培養（1.79g/L）和流加NH3·H2O控制pH培養（3.74g/L）分別提高了167.6%和28.07%，此時測定發酵液中活菌數為1.95×1011CFU/mL。從乳糖消耗變化過程（圖5B）可以看出，0.5mL/min補料后殘糖逐漸下降，說明補加乳糖量小于菌體消耗的乳糖，而以1.5mL/min補料前期乳糖先升后降，此時菌體生長較快，而后期補料量的增加使乳糖濃度持續增加，此時由于發酵液體積增加的稀釋作用使菌濃度下降。采用補料培養的方法，可以有效地增加發酵培養基中的總糖濃度，從而提高了發酵液中菌體濃度和原料的利用率。

圖5 不同補料速率條件下菌體生長（A）、乳糖消耗（B）隨時間的變化過程

3 結論

利用乳清粉為主要原料，在5L發酵罐上對Lactobacillus casei STL3102的pH控制和補料高密度培養條件進行了研究。結果表明，加堿控制pH對菌體生長有利，控制pH后的菌體干重均高于空白對照，其中控制pH為6.0效果較好。流加不同堿液對菌體干重的積累存在差異，流加NH3·H2O菌體的產量最高，24h時菌體干重達3.74g/L。對補料高密度培養菌體進行了初步研究，采用30g/L為初始乳清濃度，流加NH3·H2O控制pH為6.0，發酵16h以1.0mL/min恒速補料，發酵44h，菌體干重達4.79g/L，比分批培養（1.79g/L）和流加NH3·H2O控制pH6.0培養（3.74g/L）分別提高了167.6%和28.07%，此時測定發酵液中活菌數為1.95×1011CFU/mL。

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High cell density cultivation of Lactobacillus casei in whey based medium

LI Yun，HUANG Zhi-dan，ZHENG Li-fen，PENG Zhi-peng，YE Xiao-jing
（Food&Fermentation Engineering Institute of the Department of Biology，Hanshan Normal University，Chaozhou 521041，China）

Lactobacillus casei STL3102 was cultivated with high cell density in whey based medium for producing concentrated fermentation starter.The conditions of pH control and fed-batch were investigated.Adding alkali was advantageous to obtain high yield of dry cell weight，and its dry cell weight reached the highest yield when pH was controlled at 6.0.Adding different alkali had significant effect on cell growth，the higher cell yield of 3.74g/L was obtained at 24h with adding NH3·H2O.The fed-batch fermentation of Lactobacillus casei STL3102 was investigated under adding NH3·H2O to control pH at 6.0.When using 30g/L initial whey and feeding at the rate of 1.0mL/min after 16h，the dry cell yield reached 4.79g/L at fermentation time 44h，and then the viable count reached 1.95×1011CFU/mL.

Lactobacillus casei；high cell density cultivation；fed-batch；whey

TS201.3

A

1002-0306（2010）12-0179-03

2009-11-30

李云（1977-），男，講師，碩士，研究方向：應用微生物學和發酵工程。

韓山師范學院青年基金資助。