泡菜中乳酸菌的分離鑒定及模擬環境脅迫抗性的研究

葛林立，董 英

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013）

泡菜中乳酸菌的分離鑒定及模擬環境脅迫抗性的研究

葛林立，董 英

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江212013）

從市售泡菜中分離到7株乳酸菌，對其進行形態學、生理生化及16S rRNA基因鑒定。基于生理生化特性和16S rRNA基因序列的同源性比較，以及系統發育分析，鑒定7株菌均為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。并進一步對所分離菌株進行低pH和高膽鹽濃度條件下存活能力測試，實驗結果表明，S-2、D-1、D-3在低pH和高膽鹽濃度條件下存活率為100%～135%，在pH1.5的培養基中4h后活菌數分別為8.4×108、8.3×108、8.1×108cfu/mL，在0.3%膽鹽條件下4h后活菌數分別為8.5×108、8.9×108、8.4×108cfu/mL。

乳酸菌，分離，鑒定，16S rRNA基因序列，抗性

泡菜（Pickles）是以蔬菜為原料，利用食鹽的滲透作用，經乳酸菌為主的微生物發酵制成的具有特定風味的發酵蔬菜制品，富含大量的活體乳酸菌［1-2］。現代微生物學研究表明，泡菜中的乳酸菌對人體具有保健功能，是微生態類益生菌中的主要群體［3］，在發酵成熟的泡菜中植物乳桿菌是優勢菌群［4］。作為一種被公認的益生菌，人們也對乳酸菌的功能性作用進行了大量研究，并獲得一些具有特定功能的乳酸菌菌株用于工業化生產。據報道，泡菜汁中富含大量的植物乳桿菌，活菌數遠遠高于國內外若干種含有乳酸菌的藥物和口服液等商品，可成為具有我國傳統特色、廉價、高效的天然微生態調節劑［5］。益生菌在人體體內發揮作用，首先要有足夠量的活體菌到達小腸［4］，這就要求益生菌對酸和膽鹽有較強的抵御能力，對體內環境有較強的適應性，即對環境脅迫有較強的抗性。Maus和Ingham用低pH處理處于生長穩定初期的乳雙歧桿菌，實驗結果證明，乳雙歧桿菌耐酸能力大大提高［6］。本研究從4種市售散裝泡菜中分離到7株植物乳桿菌，對其進行形態學和生理生化初步鑒定，然后采用16S rRNA基因序列分析方法在分子生物學水平上對所分離菌株進行鑒定。以MRS為培養基，模擬正常人體胃液低pH（正常人體胃液pH1.5～4.5）和十二指腸高膽汁鹽（正常人體小腸中濃度為0.03%～0.3%）的環境，以本實驗室保存的一株植物乳桿菌為參照，對比研究7株植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）的抗脅迫能力，選育出在低pH和高膽鹽濃度條件下具有強存活能力的菌株，為功能性泡菜開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

散裝泡菜 市售，共四種；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum） 本實驗室保存，作為參照；分離培養基 固體MRS培養基、液體MRS培養基［7］。

3730型全自動測序儀 美國ABI公司；PTC-200型DNA擴增儀 美國MJ research INS公司；凝膠成像系統 美國伯樂公司；電泳儀、電泳槽 南京新科技生物技術研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的分離純化 取1mL泡菜汁用生理鹽水進行10倍梯度稀釋，選取合適的稀釋梯度，采用傾注法用含2%CaCO3的MRS固體培養基傾倒平板，經37℃恒溫培養48h后。挑取溶鈣圈較大的菌落，在MRS固體培養基上劃線分離純化3次，最后選擇單菌落。凡是革蘭氏陽性，過氧化氫酶實驗陰性的初步確定為乳酸菌［8］。革蘭氏染色，鏡檢，保留革蘭氏陽性、過氧化氫酶實驗陰性、單個成對或鏈狀排列的短或長桿菌，確認純種后4℃斜面保存，供下一步鑒定用。

1.2.2 生理生化特性測定［7］對分離的菌株分別進行明膠液化實驗、吲哚實驗、H2S實驗、硝酸鹽還原實驗、運動性實驗、碳水化合物發酵實驗。

1.2.3 16S rRNA序列擴增鑒定

1.2.3.1 引物16S rRNA序列擴增鑒定 正向引物27F（5′-AgAgTTTgATCCTggCTCAg-3′）；反向引物1541R（5′-AAggAggTgATCCAgCCgCA-3′）；由上海生工生物技術有限公司合成。

1.2.3.2 模板DNA的制備 挑取半環對數生長初期的菌落加入到200μL雙蒸水中，混合均勻。

1.2.3.3 PCR擴增反應 雙蒸水22μL，2×PCR mix 25μL，27F 1μL，1541R 1μL，模板DNA 1μL。

1.2.3.4 PCR反應條件 95℃預變性5min，95℃變性1min，55℃復性1min，72℃延長1.5min，循環30次，72℃延長10min。

1.2.3.5 PCR產物的檢測 取5μL PCR擴增產物與一定比例的上樣緩沖液混合后進行1%瓊脂糖凝膠電泳（1×TAE電泳緩沖液，80V電泳50min），EB（0.5μL/mL）染色后在凝膠成像系統紫外光透射觀察結果、拍攝電泳圖，PCR產物為約1.5kb大小的電泳條帶，送專業測序公司測序。

1.2.4 菌懸液的制備 將各供試菌株在MRS液體培養基中活化2次，轉接到MRS液體培養基中，于37℃培養18h后，取其發酵液在室溫下4000r/min離心15min，用滅菌生理鹽水洗滌2次，再用液體MRS培養基調菌懸液濃度約為8.0×109cfu/mL。菌懸液置于4℃冰箱冷藏備用。

1.2.5 低pH條件下菌株存活能力測試［4，6，9-10］將制備好的菌懸液以10%接種量分別接種在 pH1.5、pH3.0、pH4.5的MRS液體培養基中，最終制成濃度約為108cfu/mL菌懸液，37℃培養4h，并采用平板計數法測定各菌株0h和4h的活菌數，設三個平行。通過活菌數的改變表示供試菌株不同pH條件下的存活能力。

1.2.6 高膽鹽濃度條件下菌株存活能力測試［4，6，9-10］將制備好的菌懸液以10%接種量分別接種在牛膽鹽含量為0.1%、0.2%、0.3%的MRS液體培養基中，最終制成濃度約為108cfu/mL菌懸液，37℃培養4h，并采用平板計數法測定各菌株0h和4h的活菌數，設三個平行。通過活菌數的改變表示供試菌株不同膽鹽濃度條件下的存活能力。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離、純化

對4種樣品進行系列稀釋后在MRS培養基平板上進行分離純化，共分離到7株乳酸菌，經革蘭氏染色、鏡檢，確定這7株菌均為革蘭氏陽性，過氧化氫酶實驗陰性，單個、成對或鏈狀排列的短或長桿狀菌株，初步確定為乳酸菌。這7株菌分別編號為：S-1、S-2、S-3、D-1、D-2、D-3、D-4。

2.2 生理生化特性測定

所分離的7株菌明膠液化實驗、吲哚實驗、H2S實驗、硝酸鹽還原實驗、運動性實驗均為陰性。初步確定分離的7株菌均為乳桿菌［8］。對分離的7株菌進行糖發酵實驗，其中，S-1、S-2、S-3、D-3、D-4均能發酵果糖、苦杏仁苷、葡萄糖、葡萄糖酸鈣、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖和木糖；D-1除不能發酵木糖外，可以發酵其他9種糖；D-2除發酵木糖弱陽性外可以發酵其他糖。通過糖發酵實驗7株菌初步鑒定為植物乳桿菌。

2.3 菌株16S rRNA基因序列

供試菌株16S rRNA的PCR擴增產物的電泳圖見圖1。圖1中從左到右依次是：Mark、S-1、S-2、S-3、D-1、D-2、D-3、D-4、Lp，其中Lp為參比菌株。結果表明，所分離菌株的16S rRNA基因序列與參比菌株的16S rRNA基因序列大小類似，約為1.5kb左右。

圖1 16S rRNA基因擴增產物電泳圖譜

2.4 菌株基于16S rRNA基因序列的分子生物學鑒定

將測序后所得菌株的部分16S rRNA基因序列輸入到NCBI基因文庫中，使用BLASTN在GenBank +EMBL+DDBJ+PDB基因庫中進行同源性搜索比較。依據同源性比較結果，在 LPSN（www.bacterio.cict.fr）網站檢索同源性較高的菌株，選擇同源性在98%以上的菌株構建系統進化樹，建樹方法采用鄰近歸并法（Neighbor Joining），應用Bioedit和MEGA4軟件進行多重比較后構建系統發育樹，如圖2所示。

根據同源性比較和系統發育樹，可以看出，分離到 的 7 株 菌 與 Lactobacillus plantarum subsp argentoratensis的親緣關系最近，可以確定7株菌均為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），該結果與前面的生理生化鑒定結果一致。

表1 不同pH條件下菌株存活能力

表2 不同膽鹽濃度條件下菌株存活能力

圖2 基于16S rRNA序列同源性的7株菌系統發育樹

2.5 低pH條件下菌株存活能力

正常人體胃液pH在1.5～4.5之間，通常pH在3.0左右，食物在胃中的停留時間一般為1.5h［11］。因此，選擇pH分別為1.5、3.0、4.5的MRS為培養基，37℃培養4h，不同pH條件下菌株存活能力測試結果見表1。

在pH為1.5的MRS培養基中，7株菌的存活率在40%～102%之間，其中：Lp、S-1、S-2、D-1、D-3存活率都在100%以上；在pH為3.0的MRS培養基中，參照菌株存活率為109%，活菌數達到9.0×108cfu/mL，S-3存活率為58%，死亡率接近50%，其他菌株存活率均超過100%；在pH為4.5的MRS培養基中，所有菌株活菌數均有所增加，D-3存活率為135%，活菌數為10.9×108cfu/mL。通過比較確定S-1、S-2、D-1、D-3對酸具有較強的抵御能力，即對低pH具有較強的抗性。

2.6 高膽鹽濃度條件下菌株存活能力

人體小腸中膽鹽含量在0.03%～0.3%之間波動，選擇牛膽鹽含量分別為0.1%、0.2%、0.3%的MRS為培養基，37℃培養4h，所分離菌株在不同膽鹽濃度條件下的存活能力見表2。

在膽鹽含量為0.1%的培養基中，8株菌存活率都在100%以上，其中：D-1比參照菌株具有更強的存活能力，存活率為109%，活菌數為8.9×108cfu/mL，可能是由于培養基中的膽鹽含量低不足以抑制乳酸菌的生長；在膽鹽含量為0.2%的培養基中，除D-4存活率下降外，其他菌株存活率超過100%，S-1、S-2、D-1、D-2、D-3存活率分別為101%、102%、107%、101%、102%，高于參照菌株。在膽鹽含量為0.3%的培養基中，S-2、D-1、D-3存活率分別為101%、106%、104%，D-1活菌數為8.7×108cfu/mL，參照菌株Lp存活率僅為85%，D-4存活率最低為53%。從表2我們可以看出，S-2、D-1、D-3對高濃度膽鹽具有較強的抗性，D-1存活能力最強，隨著膽鹽濃度的增加，D-1存活率沒有明顯的降低，存活率均在100%以上。

3 結論

從市售散裝泡菜中分離到7株乳酸菌，經形態學觀察、生理生化鑒定和16S rRNA基因序列分析，鑒定其為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）；從中篩選出對低pH和高膽鹽濃度均具有較強抗性的菌株S-2、D-1、D-3，其在低pH和高膽鹽濃度條件下存活率為100%～135%，具有良好的益生菌開發潛力。

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Study on the isolation，identification and antagonistic property of lactic bacteria from pickle

GE Lin-li，DONG Ying
（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，China）

7 strains of lactic acid bacteria were isolated and identified from many sorts of pickle.Their physiological，biochemical properties and 16S rRNA gene sequence were characterized.Based on their physiological and biochemical properties，homology and phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequence，7strains were Lactobacillus plantarum.These strains were further characterized for the presence of functional traits useful for probiotic applications，such as resistance to acid and resistance to bile salts.S-2，D-1 and D-3 showed survival rates ranged from 100%to 135%，and expressed acid tolerance at pH 1.5 after 4h incubation and the living bacteria number reached 8.4×108，8.3×108and 8.1×108cfu/mL，respectively.Similarly，these bacteria expressed tolerance to bile salts at the concentration of 0.3%，after 4h incubation and the living bacteria number reached 8.5× 108，8.9×108，8.4×108cfu/mL.

lactic acid bacteria；isolation；identification；16S rRNA gene sequence；antagonistic property

TS255.54

A

1002-0306（2010）12-0189-04

2009-12-17

葛林立（1983-），男，在讀碩士研究生，從事乳酸菌直投式發酵劑的研究與開發。

江蘇省科技計劃項目（BG2007339）。