發酵條件對嗜熱鏈球菌ST1發酵乳粘度的影響

張鐵華，張春紅，李盛鈺，陳玉江，鄭 健，楊貞耐，*

（1.吉林省農業科學院農產品加工研究中心，吉林長春130033；2.吉林大學軍需科技學院，吉林長春130062）

發酵條件對嗜熱鏈球菌ST1發酵乳粘度的影響

張鐵華1，2，張春紅2，李盛鈺2，陳玉江2，鄭 健2，楊貞耐1，2，*

（1.吉林省農業科學院農產品加工研究中心，吉林長春130033；2.吉林大學軍需科技學院，吉林長春130062）

對一株產粘嗜熱鏈球菌ST1的形態進行了觀察，探討了pH、溫度、不同碳源和乳清濃縮蛋白（WPC）對嗜熱鏈球菌ST1發酵脫脂乳粘度、酸度的影響。該菌株經活化，在全脂乳固體培養基上培養后、采用結晶紫染色，在顯微鏡下觀察到菌體呈球形或卵形，鏈狀分布，菌體表面沒有莢膜。用ST1發酵10%脫脂乳，獲得了不同發酵時間下表觀粘度和滴定酸度的變化情況，優化出嗜熱鏈球菌ST1發酵脫脂乳產粘的條件為：pH 6.5，溫度42℃，添加2%（w/v）蔗糖或0.5%（w/v）WPC392。

嗜熱鏈球菌ST1，發酵脫脂乳，粘度，滴定酸度，發酵條件

脫脂乳經乳酸菌發酵后粘度會發生一定的變化，不同菌種凝乳的粘度不同，其中產粘較顯著者稱之為粘性菌株。產粘乳酸菌在發酵乳中的應用在法國和荷蘭倍受重視，因為這些國家禁止在非果味酸奶中添加植物性或者動物性穩定劑。許多資料報道，乳酸菌產生的粘性物質成分復雜，通常含有多糖類化合物，有的粘性物質具有一定的抗癌性，有些粘性菌株具有顯著的降膽固醇作用［1］。粘度與攪拌型酸奶的感官質量密切相關，攪拌型酸奶在貨架期容易產生乳清析出現象，風味變差，同時降低了粘度。乳酸菌產粘特性受諸多因素的影響，如發酵溫度、pH、培養基組成等，可以通過優化發酵條件的方式來提高脫脂酸奶的粘稠度，從而解決產品感官質量問題。國外很多研究者指出乳酸菌能夠產生高分子量的多糖，從而提高發酵產品的粘度［2］。用產粘性多糖的德式保加利亞乳桿菌培養時，酸乳的粘度明顯升高［3］。另外，粘性嗜熱鏈球菌LY03產生大量的高分子量多糖，能顯著提高發酵乳的粘度［4］。本研究對一株產粘的嗜熱鏈球菌ST1在發酵凝乳過程中酸乳粘度和滴定酸度的變化進行了量化測評，優化了影響表觀粘度變化的發酵條件，為新型低脂酸乳保健產品的開發提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蔗糖、乳糖、葡萄糖、半乳糖和果糖 均為食用級；乳清濃縮蛋白（WPC392） 購買于 ADF（American Dariyfoods）公司；進口脫脂奶粉 新西蘭；伊利全脂奶粉 市售；嗜熱鏈球菌ST1 來源于吉林省農業科學院農產品加工研究中心，菌種儲存在-80℃條件下，用10%（w/v）脫脂乳添加30%（v/v）的甘油作為冷凍保護劑，嗜熱鏈球菌在42℃下培養18h，活化三次后，用于后續的發酵實驗；全脂乳固體培養基 10%（w/v）全脂乳、1.1%瓊脂和0.01%剛果紅，將瓊脂用蒸餾水完全溶解，在微波爐內加熱1min后倒入加有剛果紅的全脂乳中，并快速攪拌均勻，然后將全脂乳瓊脂培養液115℃滅菌15min后進行倒板；脫脂乳液體培養基 10%（w/v）脫脂乳，在115℃滅菌15min后作為發酵培養基，起始 pH用0.1mol/L NaOH和1mol/L乙酸進行調節，堿和酸均用0.22μm的微孔濾膜進行過濾后加入已滅菌的脫脂乳中。

Brookfield DV-Ⅲ粘度儀 Brookfield Engineering Labs Inc.，Stoughton，MA；HY-5A型回旋式振蕩器江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；DHP-9272恒溫培養箱 上海一恒公司；正置熒光顯微鏡 日本Olympus公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 嗜熱鏈球菌ST1的形態特征觀察 在全脂乳固體培養基上培養ST1 8h后，在剛果紅形成的淺紅色背景下獲得肉眼可見的乳白色菌落。挑取一環菌落放在載玻片上，加一滴墨汁，用蓋玻片輕輕平鋪成平面以便觀察，然后放在無菌操作臺上用風吹干，加一滴結晶紫進行染色30s～1min并風干后用蒸餾水輕輕沖洗掉結晶紫，然后在顯微鏡下進行觀察。

1.2.2 發酵乳表觀粘度的測定 將酸奶樣品浸沒于粘度計轉子刻度以上，放入溫度探棒，待溫度穩定在20℃之后，轉速為100r/min，用3號轉子測定1min后的表觀粘度。

1.2.3 發酵乳酸度的測定 吸取10mL發酵乳，置于100mL的三角瓶中，加入蒸餾水20mL，加入1滴0.5%的酚酞乙醇溶液，小心搖勻，用0.1mol/L的氫氧化鈉溶液滴定到微紅色，在1min內不消失為測定終點（終點用0.005%堿性品紅溶液做對照）。具體計算：

式中：VNaOH為消耗的氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；V1為空白溶液消耗的氫氧化鈉標準溶液的體積，mL；CNaOH為標準氫氧化鈉溶液的濃度，mol/L。

1.2.4 取樣 用嗜熱鏈球菌ST1發酵10%（w/v）脫脂乳48h，接種量1%。從0時刻起開始收集樣品，以后每隔16h取樣，測定表觀粘度和滴定酸度。

1.2.5 數據統計分析方法 本研究采用兩次獨立的重復實驗，每次做三個平行實驗；采用Sigma plot 10.0軟件作圖。

2 結果與討論

2.1 嗜熱鏈球菌ST1的形態特征

在正置熒光顯微鏡下嗜熱鏈球菌ST1的個體形態見圖1，菌體呈球形或卵形，成鏈狀排列，菌體表面沒有莢膜。

圖1 嗜熱鏈球菌ST1的個體形態特征

2.2 發酵條件對發酵乳粘度、酸度的影響

2.2.1 pH對發酵乳粘度、酸度的影響 在37℃不同初始pH（5.0、5.5、6.0、6.5和7.0）條件下用ST1發酵脫脂乳，結果如圖2，可以看出，在相對較低的pH（5.0、5.5、6.0）條件下，菌體不能充分利用營養物質來滿足自身的生長，生成多糖和分解蛋白質等大分子物質的能力較低［5］，使得發酵乳的粘度相對較低，對應的最大粘度值在發酵32h或48h后獲得，分別為128.4、198.0、190.8cps。在pH6.5條件下發酵至32h，菌體生長情況良好，發酵乳的粘度和酸度均呈現直線增加趨勢，產粘和產酸情況很好，最大值分別為369.5cps（32h）和86.9°T（48h）。在pH7.0條件下，菌體的產粘情況比pH6.5條件下稍差些，但優于較低pH（5.0、5.5、6.0）條件下的產粘情況。根據上述結果，確定pH6.5為嗜熱鏈球菌ST1發酵脫脂乳的最佳初始pH，用于后續實驗中。

圖2 不同pH對發酵脫脂乳表觀粘度（a）和滴定酸度（b）的影響

2.2.2 溫度對發酵乳粘度、酸度的影響 在pH6.5不同溫度（30、37、42℃）條件下用ST1發酵脫脂乳，從圖3可以看出，在發酵過程中，30℃時發酵乳在發酵后期的滴定酸度高于37℃和42℃時的酸度，并在發酵至32h獲得了最大值134.1°T，而37℃和42℃發酵過程中得到的滴定酸度差異不大。有關粘度的實驗結果表明，菌株在低于其適宜生長溫度時產粘較低，隨著溫度的升高粘度呈上升趨勢。30℃時，菌體生長緩慢，隨著發酵時間的延長粘度逐漸增加，在發酵至48h獲得最大粘度值（173.5cps）；37℃時發酵至32h獲得了最大的粘度值（191.2cps）。42℃發酵產生的最大粘度值（259.6cps）大于30℃和37℃的最大粘度值，并且在發酵16h后獲得。上述結果表明酸度與粘度呈一定的負相關［6］，酸度越高，酸奶的粘度越低，可能是酸度過大破壞了發酵乳已形成的膠體結構，使乳清分離，從而影響酸奶的粘度，也可能是高酸度環境對胞外多糖保持其質構有影響。同時，ST1在較高溫度下發酵更有利于發酵奶在最短的時間內提高粘度；而 Lactoccus lactis subsp cremoris LC 320在20～35℃范圍內其粘度呈較高的水平，在35℃時有所下降［7］。有關乳酸菌產粘特性受溫度的影響作用在國外已有許多報道，Garcia-Garlbay等的研究報 道： Laccobacillus delbrueckll ssp bulgaricus NCFB2772在較高的溫度時表現出優良的產粘特性［8］，Grobben等對該菌株的產粘特性的研究表明：在42℃培養溫度下，NCFB2772可以產生較大粘性，但在高于45℃時產粘急劇下降，甚至失去了產粘特性［9］。

圖3 不同溫度對發酵脫脂乳表觀粘度和滴定酸度的影響

2.3 碳源對發酵乳粘度、酸度的影響

在pH6.5，42℃條件下用ST1發酵加入2%（w/v）不同碳源（蔗糖、乳糖、葡萄糖、半乳糖和果糖）的脫脂乳，用空白脫脂乳作對照。從圖4可以看出，在脫脂乳中添加不同的碳源，發酵乳粘度值有不同的變化。相對于空白脫脂乳發酵至16h獲得最大粘度值（259.6cps），添加碳源后發酵脫脂乳獲得最大值的時間延長，在發酵至32h獲得。碳源對粘度的影響效果為果糖（600.0cps）＞乳糖（479.0cps）＞蔗糖（298.0cps）＞ 葡 萄 糖（271.0cps）＞ 半 乳 糖（195.3cps）。有關酸度的實驗結果表明，與加入其他碳源相比，加入半乳糖的發酵乳中滴定酸度相對較低。發酵至48h，果糖（98.1°T）＞乳糖（91.0°T）＞蔗糖（83.4°T）＞葡萄糖（76.5°T）＞半乳糖（65.0°T），均低于空白樣發酵至48h得到的滴定酸度（104.5°T）。碳源的添加使得菌體的生長情況更好，分解蛋白質和合成粘性物質的能力得到提高，ST1利用果糖、乳糖和蔗糖的效果較好，而利用半乳糖的效果較差。并不是所有的嗜熱鏈球菌有能力利用蔗糖，從粘度和工業大量生產的低成本要求考慮，嗜熱鏈球菌ST1利用蔗糖效果較好，可以應用于甜制發酵乳品中。

圖4 不同碳源對發酵脫脂乳表觀粘度（a）和滴定酸度（b）的影響

2.4 氮源對發酵乳粘度、酸度的影響

據報道，應用乳清濃縮蛋白可以為酸奶提供獨特的功能特性，可改善酸奶的風味、硬度和粘度，降低酸味感，防止乳清析出［10-12］。在pH6.5，42℃下用ST1發酵加入0.5%（w/v）WPC392的脫脂乳，從圖5可以看出，在發酵過程中，滴定酸度隨著發酵時間的延長不斷增加，發酵初期增加速度較快，發酵至16h趨于穩定，發酵48h后的滴定酸度分別為93.0°T（空白脫脂乳）和79.4°T（加WPC392的脫脂乳）。發酵至16h，對照組發酵乳的粘度達到最大值259.6cps；發酵至32h，添加WPC392的發酵乳粘度達到最大值270.3cps。牛龍江等人的研究指出，蛋白質具有較強的緩沖能力，酸奶貯藏過程中，乳清蛋白的緩沖作用能防止乳酸過多引起的pH急劇下降，從而有利于產品中保持較高的乳酸活菌菌數，并延緩了酸乳因酸度降低而引起的品質變差［13］。酸奶中的乳酸菌進入衰亡期后還有部分菌有一定的活力，能夠分解蛋白質，使酸奶的質構受到破壞，從而引起粘度下降和滴定酸度的增加。

圖5 WPC392對發酵脫脂乳表觀粘度和滴定酸度的影響

3 結論

3.1 本研究采用的添加有剛果紅的全脂乳固體培養基，首次應用在嗜熱鏈球菌菌落分離中，在其他文獻中未見報道；在淺紅色背景下，培養ST1 8h后可以獲得清晰的乳白色菌落；菌體經結晶紫染色，在顯微鏡下觀察呈球形或卵形，成鏈狀排列，菌體表面沒有莢膜。

3.2 嗜熱鏈球菌ST1發酵脫脂乳產粘適宜條件：pH 6.5，溫度42℃，添加2%（w/v）蔗糖或0.5%（w/v）WPC392。嗜熱鏈球菌ST1利用蔗糖效果較好，可以應用于甜制發酵乳品中。

［1］Hajime N，et al.Cholesterol-lowing Activity of Ropy Fermented milk［J］.Journal of Food Science，1992，52（6）：1327-1329.

［2］Guzel-Seydim，etal.Influencesofexopolysaccharide producing cultures on the quality of plain set type yogurt［J］.Food Control，2005，16：205-209.

［3］Petry S，et al.Comparison of the thickening properties of four Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus strains and physicochemical characterization of their exopolysaccharides［J］. FEMS Microbiology Letter，2003，221：285-291.

［4］DeVuyst L，et al.Exopolysaccharide-producing Streptococcus thermophilus strains as functionalstarter cultures in the production of fermented milks［J］.International Dairy Journal，2003，13：707-717.

［5］Cheirrsilp B，et al.Modeling and optimization of environmental conditions for kefiran production by Lactobacillus kefiranofaciens［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2001，57：639-646.

［6］李勇，董翠芳，歐國兵.攪拌型酸奶流變學特性及粘彈性的分析與討論［J］.乳品加工，2009（1）：46-50.

［7］ Valerie M，etal.Analysis and production oftwo exopolysaccharides from lactoccus lactis subsp cremoris LC320［J］.Dairy Res，1995，52：621-628.

［8］Garcia-Garibay M，et al.Polymer production by Laccobacillus delbrueckll ssp bulgaricus［J］.Appl Bacteriol，1995，79：103-107.

［9］Grobben G J，et al.Production of extracellular polysaccharides by lactobacillus bulgaricus NCFB 2772 grown in a chemically defined medium［J］.Appl，Bacterial，1995，79：103-107.

［10］張旭輝，龍芳羽，孫建，等.乳清蛋白的功能特性及其在酸奶中的應用［J］.中國奶牛，2006（6）：46-48.

［11］韓婷，蔡東聯.乳清蛋白的功能特性及其在酸奶中的應用［J］.腸外與腸內營養，2005，12（4）：243-246.

［12］De Wit J N.Nutritional and Functional Characteristics of Whey Proteins in Food Products［J］.Journal of Dairy Science，1998，81：597-608.

［13］牛龍江，楊金海，謝明.淺談乳清蛋白及低聚糖在酸牛奶中的可利用性［J］.中國乳品工業，2005，33（6）：54-56.

Effect of cultural conditions on the viscosity of fermented milk by Streptococcus thermophilus ST1

ZHANG Tie-hua1，2，ZHANG Chun-hong2，LI Sheng-yu1，CHEN Yu-jiang2，ZHENG Jian2，YANG Zhen-nai1，2，*
（1.Center of Agro-food Technology，Jilin Academy of Agricultural Sciences，Changchun 130033，China；2.College of Light Industry and Economics&Management，Jilin University，Changchun 130062，China）

The morphologic characteristics of a slime-producing strain，Streptococcus thermophilus ST1 were studied.By crystal violet staining，the strain grown on a full-fat milk solid medium was observed by microscopy to be globular or oval without capsules on the bacterial surface，and the bacteria cells were presented in chains.The effects of pH，temperature，supplementation with carbon sources and whey protein concentrate（WPC）on the viscosity of fermented skim milk by S.thermophilus ST1 were studied when the strain was grown in 10% reconstituted skim milk.According to the results of the apparent viscosity and titration acidity of the fermented samples，the optimized cultural conditions for slime production by S.thermophilus ST1 were pH 6.5，temperature 42℃，2%（w/v）sucrose or 0.5%（w/v）WPC392.

Streptococcus thermophilus ST1；fermented skim milk；viscosity；titration acidity；fermentation conditions

TS201.3

A

1002-0306（2010）12-0206-04

2010-01-08 *通訊聯系人

張鐵華（1970-），男，博士，副教授，研究方向：農產品精深加工。

現代農業產業技術體系建設專項資金資助（nycytx-0502）；吉林省科技發展計劃項目（20090225）。