曲酸生產菌的60CO-γ射線誘變選育及表征

解西玉，曾柏全，周小芹，許 志，宋 睿

（中南林業科技大學生命科學與技術學院，湖南長沙410004）

曲酸生產菌的60CO-γ射線誘變選育及表征

解西玉，曾柏全*，周小芹，許 志，宋 睿

（中南林業科技大學生命科學與技術學院，湖南長沙410004）

為了獲得高產曲酸菌株，采用不同劑量60Co-γ射線對出發菌株米曲霉進行輻射誘變處理。結果表明，當60Coγ射線輻射劑量為800Gy時，對出發菌株的誘變效果最好，使突變菌株C8-128的曲酸產量由出發菌株的15.68g/L增加到61.5g/L，產量提高292.2%，經遺傳穩定性實驗，得出其有良好的遺傳穩定性，產酸能力穩定。將篩選出的高產曲酸菌株C8-128通過菌落形態和搖瓶發酵培養特征與親株進行比較，得出出發菌株經60Co-γ射線輻射誘變后產生的一些特征性變化。

60Co-γ射線，曲酸，米曲霉，誘變，表征

曲酸（kojic acid），化學名α-羥甲基-5-羥基γ-吡喃酮，是由微生物好氧發酵產生的具有殺菌作用的次級代謝產物［1-4］；是由葡萄糖未經碳架斷裂［5］，直接氧化脫水而成。該化合物作為美白祛斑劑、防腐劑、止痛劑、抗紫外線輻射劑、殺蟲劑等被廣泛應用于化妝品、食品、醫藥、農業生產等多個領域［6-8］；此外，曲酸還可作為合成生物可降解塑料的原材料［9］、香料合成的中間體等。自20世紀70年代以來，由于曲酸的廣泛應用，國內外很多著名學者都對曲酸的發酵生產進行了廣泛而深入的研究，并取得了一定進展。60Co-γ射線是電離生物學上應用最廣泛的電離射線之一［10］，它能引起水和其他物質的離子化，從而產生間接的誘變效應［11］，此法具有突變率高、后代性狀穩定、育種周期短等優點［12］。本研究通過利用60Co-γ射線對出發菌株進行誘變選育，旨在降低曲酸生產成本，提高生產效率，為曲酸的工業化生產奠定堅實基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

米曲霉（Aspergillums oryzae） 由本生物工程實驗室從霉變的冰糖橙皮上篩選獲得；曲酸標準樣品德國Riedel-de Haen公司，分析純；斜面保藏培養基 PDA培養基；活化培養基 葡萄糖10%、酵母膏0.5%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.25%，pH6.0；篩選培養基 活化培養基中加入0.1%FeCl3；搖瓶發酵培養基 葡萄糖10%、酵母膏0.25%、KH2PO40.5%、MgSO4·7H2O 0.25%，pH 6.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 測定方法

1.2.1.1 曲酸含量測定 采用Fe3+-HCl［13］法。

1.2.1.2 生物量的測定 取 50mL發酵液離心（5000r/min，20min），收集濕菌體，置60℃下恒溫干燥至恒重（M），用稱重法測定其生物量，生物量（g/L）=M×20

1.2.2 誘變方法

1.2.2.1 孢子懸液的制備 用生理鹽水將出發菌株斜面上的孢子洗下，倒入裝有玻璃珠的250mL三角瓶中，置于轉速180r/min的旋轉搖床上旋轉30min，待孢子分散成單個孢子后用無菌脫脂棉過濾，得單孢子懸浮液。血球計數板計數，調整孢子濃度為106個/mL。

1.2.2.260Co-γ射線誘變 20mL孢子懸液于50mL無菌三角瓶中，在湖南原子能研究所，分別以400、600、800、1000Gy的γ射線輻射劑量對其進行輻射誘變處理。

1.2.3 搖瓶發酵 挑取一環斜面培養5d的出發菌株孢子于裝有50mL發酵培養基的250mL搖瓶中，置于轉速為200r/min的旋轉式搖床上，恒溫30℃發酵培養7d。

2 結果與分析

2.1 γ射線對出發菌株致死率和突變率的影響

一切誘變劑都具有殺菌和誘變雙重效應，因此確定射線輻射誘變后菌株的致死率和突變率顯得很有必要。γ射線輻射后的菌懸液適當梯度稀釋涂布平板后培養3d，以未照射菌懸液作為對照，計算在不同γ射線輻射劑量下輻照后的孢子致死率。分別挑取各不同γ射線輻射劑量誘變后的菌株50株，進行搖瓶發酵產酸實驗，測其曲酸產量。規定產酸能力超過出發菌株5%及以上的突變株為正突變株，產酸能力低于出發菌株5%以下的菌株為負突變株，計算各不同γ射線輻射劑量照射下的正突變率和負突變率，結果見圖1。

圖1 不同γ射線輻射劑量下的致死率和突變率

從圖1可以看出，γ射線對此菌株有較好的誘變效應。致死率與射線輻射劑量成正比關系，即輻射劑量越大，菌株致死率越高。在低劑量范圍內，孢子存活率較高，突變率隨射線輻射劑量的增大而增大，當輻射劑量為800Gy時，殺菌率為81.6%，正突變率達最大值54.7%，但當劑量為1000Gy時，正突變率卻迅速降低為6.8%，而負突變率卻升為最大，由此確定γ射線對此出發菌株的最佳誘變劑量為800Gy。

2.2 γ射線誘變對曲酸產量的影響

選取800Gy γ射線輻射劑量下R值（變色圈直徑與菌落直徑的比值）較大，且紅色暈圈顏色較深的200株單菌落接種于斜面培養，并進行反復發酵產酸實驗，最終將產酸能力較高的突變株列出，見表1。

表1 曲酸產量較高的突變株

由表1可以看出，γ射線的輻射劑量為800Gy時，對出發菌株有非常好的誘變效應，這說明從冰糖橙皮上分離出的野生型菌株對γ射線有較強的敏感性。其中，產酸量最高的菌株C8-128可以產生曲酸61.5g/L，產量提高292.2%。

2.3 遺傳穩定性實驗

將上述4株突變株傳代六次，并對每一代菌株都進行搖瓶發酵產酸實驗，結果表明，突變株C8-128有較高的遺傳穩定性，每一代菌株的曲酸產量都能維持在穩定范圍內。

2.4 突變株與親株的比較

2.4.1 突變株與親株的菌落形態比較 由圖2、圖3可以看出，突變株C8-128的菌落直徑小于親株，且生長速度稍慢；但突變株C8-128在生長早期即能產生大量曲酸（為了既不影響菌落形態的觀察又不影響紅色暈圈的觀察，此平板培養基中只加入0.001%的FeCl3）。此結果符合以往經驗，即菌物體生長越旺盛，產物的生成量越少。

圖2 突變株

圖3 親株

2.4.2 突變株與親株的搖瓶發酵特征比較 由表2可以看出，突變株C8-128搖瓶發酵產酸實驗時，其菌絲球比親株的菌絲球小1倍多，使培養基中營養成分到菌球體內部的物質傳遞受限度變??；發酵液的粘稠度也比親株小很多，此優勢增加了氧溶解和營養物質的傳遞速率，同時也能使培養液的后處理變得更加容易；終pH比親株的更接近空白培養基的pH（在同樣條件下，未接入菌體的發酵培養基在旋轉搖床上旋轉培養相同時間后的培養基為空白培養基，其終pH為5.11），這說明，突變株在搖瓶發酵培養過程中能維持較高pH環境，因為過低的pH環境不利于產物的生成；生物量是親株的3倍多，與以往記載相吻合，即在一定條件下，生物量越多，菌株產生的目的產物也越多。

表2 突變株與親株搖瓶發酵特征

3 結論

實驗表明，γ射線誘變米曲霉產生曲酸是有效的，不僅在曲酸得率上有較大提高，而且菌株的培養特征也有所變化，其最佳輻射誘變劑量為800Gy。本實驗篩選到的高產曲酸菌株C8-128的曲酸產量比親株提高了292.2%，最終產量達到了61.5g/L，經6代穩定性遺傳實驗，確定其產酸能力能維持在一個恒定的水平。通過對突變株C8-128的菌落形態的觀察，及搖瓶發酵產酸實驗時的一些培養特征，得出突變株的優越性：菌落在平板上長出的菌落大小適中，生長早期即能產生大量曲酸；搖瓶發酵實驗時菌絲球較小，發酵液粘稠度小，終pH能維持在有利于曲酸生成的較高pH水平，生物量也比出發菌株多。

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Study on60Co-γ irradiation mutation breeding of kojic acid production strain and its characterization

XIE Xi-yu，ZENG Bai-quan*，ZHOU Xiao-qin，XU Zhi，SONG Rui
（College of Life Science，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004，China）

Asperqillus oryzae were irradiated by different doses of60Co-γ rays to obtain high-yielding strains of kojic acid.The results indicated that，when the dose of the60Co-γ rays was 800Gy，it could have the best mutation effect to the start strain.The kojic acid yield of the mutant increased from original 15.68g/L to 61.5g/L，increased by 292.2%.lt had a good genetic stability and stably acid producing.To obtain the characteristics changes of the C8-128 which has a high yielding of kojic acid，it was compared to the starting strain in colony morphology and fermentation characteristics in flask.

60Co-γ ray；kojic acid；Asperqillus oryzae；mutation；characterization

TS201.3

A

1002-0306（2010）12-0212-03

2009-11-23 *通訊聯系人

解西玉（1986-），女，在讀碩士，從事微生物發酵方面的研究。