黑曲霉生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型

張小昊，童群義

（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

黑曲霉生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型

張小昊1，童群義2，*

（1.江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122）

對(duì)黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)特性進(jìn)行了研究，通過對(duì)Logistic方程，Luedeking-Piret方程和Luedeking-Piret/Like方程進(jìn)行最優(yōu)參數(shù)估計(jì)和非線性擬合，得到了描述發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)、葡萄糖酸鈉合成、葡萄糖消耗的動(dòng)力學(xué)模型。對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)模型預(yù)測(cè)值與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)能較好地?cái)M合，基本上反映了黑曲霉分批發(fā)酵過程的動(dòng)力學(xué)特征，結(jié)果還表明葡萄糖酸鈉的發(fā)酵合成是部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型的。

黑曲霉，葡萄糖酸鈉，動(dòng)力學(xué)模型

葡萄糖酸鈉是一種多羥基羧酸鈉，又名五羥基己酸鈉，是一種白色或淡黃色結(jié)晶粉末，易溶于水，微溶于醇，不溶于醚。其分子式為C6H11O7Na，相對(duì)分子質(zhì)量為218.14［1］。葡萄糖酸鈉是葡萄糖的深加工產(chǎn)品，也是制備葡萄糖酸內(nèi)酯、葡萄糖酸鹽（鋅、銅、亞鐵鹽）等的基礎(chǔ)原料，在食品工業(yè)中可用作營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑、固化劑、緩沖劑等［2-3］。該產(chǎn)品熱穩(wěn)定性好，無潮解性，由于其優(yōu)良的螯合性能而被廣泛用于水質(zhì)處理、電鍍、金屬與非金屬的表面清洗及水泥生產(chǎn)等多種工業(yè)部門，在化工、食品、醫(yī)藥等行業(yè)也有廣泛的用途。目前對(duì)于發(fā)酵法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的研究主要集中在菌種選育、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化等方面［4-6］，對(duì)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)方面的報(bào)道較少［7］，且實(shí)驗(yàn)條件與工業(yè)發(fā)酵條件差異較大。本研究在5L發(fā)酵罐中進(jìn)行葡萄糖酸鈉的高糖分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，研究了發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物生成和底物消耗的動(dòng)態(tài)平衡及其內(nèi)在規(guī)律，獲得了相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)數(shù)學(xué)模型和模型參數(shù)，為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的放大和由分批發(fā)酵過程到連續(xù)發(fā)酵過程提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉（Aspergillus niger）M2632 由本實(shí)驗(yàn)室誘變篩選得到，該菌株有較高的葡萄糖氧化酶和過氧化氫酶活力；斜面培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基（g/L） 葡萄糖80、MgSO4·7H2O 0.2、KH2PO40.3、（NH4）2HPO40.6，自然pH（約6.5）；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）葡萄糖250、其它同種子培養(yǎng)基，自然pH（約6.0）；葡萄糖、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、磷酸氫二銨、氫氧化鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純。

LS-B50L型立式壓力蒸汽滅菌鍋 上海華線醫(yī)用核子儀器有限公司；UV2000型分光光度計(jì) 尤尼柯儀器有限公司；PHS-3C型精密pH計(jì) 杭州雷磁分析儀器廠；HH-S24型恒溫水浴鍋 金壇市大地自動(dòng)化儀器廠；AB104-N型電子天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰空氣技術(shù)有限公司；303-4型恒溫培養(yǎng)箱南通科學(xué)儀器廠；HYG-Ⅱa型回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖瓶柜 上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；KF-5L型發(fā)酵罐 高百特發(fā)酵機(jī)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

1.2.1.1 斜面種子培養(yǎng) 將4℃貯藏的斜面菌種接種到新鮮的PDA斜面上，28℃下恒溫培養(yǎng)3d。

1.2.1.2 搖瓶種子培養(yǎng) 從斜面培養(yǎng)基上挑取幾環(huán)黑曲霉孢子，接入裝有50mL種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于30℃，250r/min下?lián)u床培養(yǎng)22h，即為種子液。

1.2.1.3 發(fā)酵罐培養(yǎng) 按10%的接種量將種子液接入滅菌后的5L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐裝液量為2L。發(fā)酵條件為：溫度 32℃，攪拌速率 550r/min，通氣量3.5NL/min，必要時(shí)用滅菌的花生油進(jìn)行消泡，發(fā)酵過程中用10.3mol/L NaOH溶液自動(dòng)控制發(fā)酵液pH在6.0。

1.2.2 分析方法

1.2.2.1 生物量的測(cè)定 定量量取發(fā)酵液，用已烘至恒重的濾紙過濾，并用蒸餾水沖洗濾出物2次，所得濾液用于殘?zhí)堑臏y(cè)定，將濾紙連同濾出物于85℃烘干至恒重，前后濾紙質(zhì)量的差值即為發(fā)酵液中的菌體生物量［8］。

1.2.2.2 殘?zhí)堑臏y(cè)定 取生物量測(cè)定過程中所得濾液，定容，取一定量濾液，采用3，5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測(cè)定［9］。

1.2.2.3 葡萄糖酸鈉的測(cè)定 用保持發(fā)酵液pH為6.0、所消耗10.3mol/L NaOH溶液的量計(jì)算得到，與葡萄糖酸鈉產(chǎn)量相比，此處忽略形成其它副產(chǎn)物消耗NaOH的量［10］。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的獲得 每隔一定時(shí)間，測(cè)定此時(shí)的生物量、殘?zhí)呛亢推咸烟撬徕c濃度。每次做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，取其平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 黑曲霉發(fā)酵過程中的生長(zhǎng)代謝變化

此前的研究已對(duì)黑曲霉發(fā)酵葡萄糖酸鈉的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，為了弄清楚黑曲霉在該培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)代謝規(guī)律，進(jìn)行了分批發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖1。

圖1 黑曲霉分批發(fā)酵曲線

從圖1可以看出，黑曲霉的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線存在延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期等幾個(gè)期段，0～4h發(fā)酵處于延滯期，菌體濃度增長(zhǎng)緩慢，大的菌絲球由于剪切力的作用逐漸變小；4～32h處于對(duì)數(shù)期，菌體生長(zhǎng)加速，菌體濃度迅速增加，菌體呈松散且分散均勻的菌絲小球狀；32h后進(jìn)入穩(wěn)定期，菌絲球體積稍有變大，菌體濃度趨于穩(wěn)定，菌體最大濃度為2.143g/L。從底物消耗和產(chǎn)物形成曲線可以看出，0～8h時(shí)，由于菌體處于延滯期，且菌體量較少，葡萄糖消耗及葡萄糖酸鈉合成均比較緩慢，8～40h，伴隨菌體量的快速增加，葡萄糖消耗及葡萄糖酸鈉合成速度加快，40h后，由于底物消耗殆盡，葡萄糖酸鈉合成減緩。從圖中還可以看出，葡萄糖酸鈉的合成在生長(zhǎng)階段和穩(wěn)定期都有大量形成，且明顯滯后于菌體的生長(zhǎng)，因此預(yù)測(cè)本實(shí)驗(yàn)條件下黑曲霉產(chǎn)葡萄糖酸鈉的發(fā)酵過程屬于部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型，即Gaden提出的Ⅱ型發(fā)酵。

2.2 動(dòng)力學(xué)模型的建立

2.2.1 黑曲霉菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型 關(guān)于菌體生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)模型，目前多采用非結(jié)構(gòu)模型來描述。Monod方程是描述菌體生長(zhǎng)較常用的模型之一，然而由于Monod方程只適用于單一限制性基質(zhì)及不存在抑制性物質(zhì)的情況，并且該模型是在假設(shè)微生物生長(zhǎng)的菌體得率為常數(shù)的情況下建立的，因此，該模型不適于本實(shí)驗(yàn)，通過初步模擬，采用Monod方程模擬確實(shí)有較大偏差。而Verhulst-Pearl提出的Logistic方程也是目前應(yīng)用較為普遍的模型之一，由于黑曲霉菌體生長(zhǎng)曲線為S形，Logistic模型也是一個(gè)典型的S型曲線，通常被看作是一個(gè)表現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之間的非線性關(guān)系的經(jīng)驗(yàn)方程，能很好地反映該過程中菌體濃度增加對(duì)自身生長(zhǎng)的抑制作用，因此，選用Logistic方程作為黑曲霉菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型。Logistic方程為：

式中：μm為最大比生長(zhǎng)速率（h-1）；t為發(fā)酵時(shí)間（h）；X為菌體濃度（g/L）；Xm為最大菌體濃度（g/L）。

當(dāng)初始條件為t=0，X=X0時(shí)，對(duì)式（1）進(jìn)行積分，可得：

式中：X0為初始菌體濃度（g/L）。

2.2.2 葡萄糖酸鈉合成動(dòng)力學(xué)模型 根據(jù)產(chǎn)物形成與菌體生長(zhǎng)的關(guān)系，Gaden將產(chǎn)物形成分成3類：a.產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)相偶聯(lián)；b.產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)部分偶聯(lián)；c.產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)沒有關(guān)系。Luedeking和Piret為此總結(jié)出Luedeking-Piret方程來描述產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)的關(guān)系［11］，即：

式中：P為葡萄糖酸鈉濃度（g/L）；α、β為動(dòng)力學(xué)參數(shù)；α（dX/dt）為與菌體生長(zhǎng)率相關(guān)的產(chǎn)物形成率；βX為非伴隨菌體生長(zhǎng)的產(chǎn)物形成率。

當(dāng)α=0，β≠0時(shí)，產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)為非偶聯(lián)型；當(dāng)α≠0，β≠0時(shí)，產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)為部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型；當(dāng)α≠0，β=0時(shí)，產(chǎn)物形成與細(xì)胞生長(zhǎng)為生長(zhǎng)偶聯(lián)型。本文中葡萄糖酸鈉的合成屬于部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型，當(dāng)初始條件t=0，X=X0，P=P0時(shí)，將方程式（1）代入式（3）進(jìn)行積分，可得：

表1 分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)估計(jì)值

式中：P0為最初葡萄糖酸鈉量（g/L）。

2.2.3 底物消耗動(dòng)力學(xué)模型 發(fā)酵過程中，底物（葡萄糖）消耗主要有三個(gè)方面：一是菌體生長(zhǎng)的消耗，即用以合成新的細(xì)胞；二是用于合成代謝產(chǎn)物的消耗；三是菌體維持基本生命活動(dòng)的消耗。因此底物消耗可用Luedeking-Piret/Like方程表示［12］，即：

式中：S為葡萄糖濃度（g/L）；Yx/s為葡萄糖用于菌體生長(zhǎng)的得率常數(shù)；Yp/s為葡萄糖用于產(chǎn)物積累的得率常數(shù)；m為維持常數(shù)。

當(dāng)初始條件t=0，X=X0，S=S0時(shí)，將方程式（1）、式（3）代入式（5）進(jìn)行積分，可得：

試卷應(yīng)用過程，如發(fā)現(xiàn)有錯(cuò)誤需要更改或更新，可以在原來的基礎(chǔ)上重新編輯考試。在編輯考試過程中，無法作答，直到編輯結(jié)束，重新發(fā)布，但修改后的試卷二維碼保持不變。編輯考試過程有保留答卷、刪除已有答卷、復(fù)制此問卷并編輯三種方式。如保留已有答卷，則編輯過程不能刪除題目，新增題目只能插入到問卷的最后；如刪除已有答卷，則修改不受限制，可以隨意刪除題目和任意位置插入新題目；如選擇復(fù)制此問卷并編輯，則原試卷及答卷均不受任何影響，新編輯的試卷二維碼和原試卷不同。

式中：S0為最初殘?zhí)橇浚╣/L）。

2.3 模型參數(shù)的求解

根據(jù)實(shí)際測(cè)得的數(shù)據(jù)，應(yīng)用國(guó)產(chǎn)1stOpt軟件，采用麥夸特法和通用全局優(yōu)化算法，分別對(duì)圖1中分批發(fā)酵的菌體生長(zhǎng)曲線、產(chǎn)物生成曲線和底物消耗曲線進(jìn)行非線性曲線擬合，得到擬合曲線，并得到參數(shù)最優(yōu)估計(jì)值（表1）。

根據(jù)表1數(shù)據(jù)，得到葡萄糖酸鈉發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)模型分別為：

菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型：

底物消耗動(dòng)力學(xué)模型：

圖2a、圖2b、圖2c分別為葡萄糖酸鈉分批發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物生成和底物消耗實(shí)驗(yàn)值與模型計(jì)算值的比較（圖中點(diǎn)表示實(shí)驗(yàn)值，線表示模型計(jì)算值），其相關(guān)系數(shù)R2分別達(dá)到0.9976、0.9948和0.9966，可見這三個(gè)模型能很好地描述分批發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)、葡萄糖酸鈉合成以及葡萄糖消耗情況。

圖2 葡萄糖酸鈉分批發(fā)酵菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物生成及底物消耗的實(shí)驗(yàn)值與模型擬合曲線

2.4 曲線擬合與模型準(zhǔn)確性分析

為了檢驗(yàn)?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，在相同發(fā)酵條件下進(jìn)行分批發(fā)酵的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)分批發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)值與模型計(jì)算值進(jìn)行比較，結(jié)果見表2。

從表2可以看出，除個(gè)別數(shù)據(jù)點(diǎn)外，大部分模型計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)值之間的相對(duì)誤差均低于10%，說明所得模型能很好地描述葡萄糖酸鈉的分批發(fā)酵過程。發(fā)酵初始的葡萄糖酸鈉濃度的實(shí)驗(yàn)值與模型計(jì)算值的相對(duì)誤差過大，這是由于實(shí)驗(yàn)值為零所致；發(fā)酵終點(diǎn)葡萄糖濃度的實(shí)驗(yàn)值與模型計(jì)算值的相對(duì)誤差也很大，可能是由于模型的建立未考慮發(fā)酵終點(diǎn)值不能為負(fù)，而且此時(shí)殘?zhí)橇拷咏诹悖瑴y(cè)量誤差相對(duì)較大，計(jì)算模型平均誤差時(shí)可不考慮這兩點(diǎn)。菌體濃度、產(chǎn)物生成和底物消耗模型計(jì)算值與實(shí)測(cè)值的平均相對(duì)誤差分別為3.36%、4.95%和3.21%，較好地反映了實(shí)際的發(fā)酵過程。

3 結(jié)論

3.1 通過對(duì)本實(shí)驗(yàn)條件下的菌體生長(zhǎng)曲線和產(chǎn)物合成曲線分析可得出，葡萄糖酸鈉量的增長(zhǎng)趨勢(shì)明顯滯后于細(xì)菌生長(zhǎng)的增長(zhǎng)趨勢(shì)，其發(fā)酵過程屬于部分生長(zhǎng)偶聯(lián)模型，即Gaden提出的Ⅱ型發(fā)酵。

3.2 采用 Logistic方程、Luedeking-Piret方程與Luedeking-Pire/Like方程，建立的葡萄糖酸鈉發(fā)酵模型能夠較好地描述黑曲霉分批發(fā)酵過程中菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物形成和底物消耗隨時(shí)間的變化過程。

3.3 該模型是在初始葡萄糖濃度較高的條件下建立的，且有很好的適用性，因此，可以用來預(yù)測(cè)高糖發(fā)酵時(shí)發(fā)酵液中產(chǎn)物的濃度，判斷發(fā)酵過程是否正常，從而對(duì)發(fā)酵條件加以改變，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程的最優(yōu)化控制。

［1］黃道震，余麗秀，王桂香，等.葡萄糖酸鈉的生產(chǎn)工藝及研究動(dòng)態(tài)［J］.河南化工，1999（5）：35-36.

［2］鄭錦華，吳紹林.葡萄糖衍生產(chǎn)品的生產(chǎn)與市場(chǎng)［J］.河南化工，1997（6）：14-15.

［3］Singh O V，Kumar R.Biotechnological production of gluconic acid：future implications［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2007，（75）：713-722.

［4］Amit S，Vivekanand V，Singh R P.Solid-state fermentation forgluconic acid production from sugarcane molasses by Aspergillus niger ARNU-4 employing tea waste as the novel solid support［J］.Bioresource Technology，2008，99：3444-3450.

［5］Mukhopadhyay R，Chatterjee S，Chatterjee B P，et al. Production of gluconic acid from whey by free and immobilized Aspergillus niger［J］.International Dairy Journal，2005，15：299-303.

［6］Ikeda Y，Enock Y P，Okuda N.Bioconversion of waste office paper to gluconic acid in a turbine blade reactor by the filamentous fungus Aspergillus niger［J］.Bioresource Technology，2006，97：1030-1035.

［7］ZNAD H，BLA?EJ M，BáLE? V，et al.A Kinetic Model for Gluconic Acid Production By Aspergillus niger［J］.Chemical Papers，2004，58（1）：23-28.

［8］路秀玲，趙樹欣.紅曲霉固態(tài)發(fā)酵中生物量的測(cè)定方法［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2000，27（6）：45-48.

［9］陳毓荃.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)［M］.北京：科學(xué)出版社，2005：95-100.

［10］Sankpal N V，Kulkarni B D.Optimization of fermentation conditions for gluconic acid production using Aspergillus niger immobilized on cellulose microfibrils［J］.Process Biochemistry，2002，37：1343-1350.

［11］陳堅(jiān)，堵國(guó)成，李寅，等.發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：281-284.

［12］于雷，裴曉林，雷霆.L-乳酸生產(chǎn)菌分批發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型［J］.食品工業(yè)科技，2008，29（5）：100-102.

Kinetic models for sodium gluconate batch fermentation by Aspergillus niger

ZHANG Xiao-hao1，TONG Qun-yi2，*
（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The kinetic models for sodium gluconate batch fermentation by Aspergillus niger were studied.Through the optimal parameters estimation and nonlinear fitting method，series of kinetic models were proposed by using the Logistic equation for cell growth，the Luedeking-Piret equation for sodium gluconate production and the Luedeking-piret/Like equation for glucose consumption.The calculated results of models were compared with experimental data，the results showed the experiment and model values were in a good agreement，the model appeared to provide a reasonable description for the batch fermentation process，and the results also showed the production of sodium gluconate was partially growth-associated.

Aspergillus niger；sodium gluconate；kinetic model

TS201.3

A

1002-0306（2010）12-0221-04

2009-12-16 *通訊聯(lián)系人

張小昊（1986-），男，碩士研究生，主要從事碳水化合物的研究。