九株谷氨酸生產菌的生物學特性研究

杜巧燕，鄭璞，*，孫志浩，何毅清

（1.江南大學生物工程學院和教育部工業生物技術重點實驗室，江蘇無錫214122；2.新加坡義安理工學院生命科學與化學工藝學學院，新加坡S599489）

九株谷氨酸生產菌的生物學特性研究

杜巧燕1，鄭璞1，*，孫志浩1，何毅清2

（1.江南大學生物工程學院和教育部工業生物技術重點實驗室，江蘇無錫214122；2.新加坡義安理工學院生命科學與化學工藝學學院，新加坡S599489）

【目的】研究九株谷氨酸生產菌的生物學特性，為具有廣域pH耐受性的谷氨酸高產菌篩選提供實驗依據。【方法】考察九株菌的低pH生長、高pH產酸特性；對磺胺胍、酮基丙二酸、丙二酸和香豆素的耐受性以及發酵特性。【結果】Corynebacterium glutamicum S9114、Corynebacterium glutamicum ATCC 13761、Corynebacterium glutamicum T613-85均能在pH3.9下生長，而在pH10.5時S9114、Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870、T613-85依然能夠產酸；抗性平板上具有明顯生長優勢的菌株如下：磺胺胍：S9114；酮基丙二酸：S9114、ATCC 13870；丙二酸：ATCC13761、ATCC13870、Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354；香豆素：除 ATCC13761和 Corynebacterium melassecola ATCC 17966，其他耐受程度相似；九株菌中產酸能力最強的是S9114，其次是T613-85。【結論】以S9114為出發菌株進行改造，確定篩選平板為含磺胺胍2%、酮基丙二酸0.25%、丙二酸1.6%、香豆素0.2%的低pH梯度（pH 3.6～4.0）平板和高pH梯度平板（pH 10.5～11.2）。

谷氨酸生產菌，pH，抗性，產酸

谷氨酸是傳統的大宗發酵產品，相比國外，我國生產指標（主要是產酸率和糖酸轉化率）普遍偏低［1］，亟需性狀優良的生產菌株。在發酵生產谷氨酸過程中，需流加氨水控制pH7.0左右，而發酵結束時，亦需向發酵液中投入大量濃硫酸調節pH 3.20～3.25，結晶谷氨酸［2］，選育耐低pH的谷氨酸生產菌株可以節約氨水以及濃硫酸用量，降低成本，具有實際生產意義；發酵流加氨水時由于粗放操作造成氨水加入量過大，或者由于攪拌問題造成發酵液局部pH過高，使菌種產酸降低，所以有必要選育能夠在高pH情況下高產酸的菌株。而對于菌種廣域pH耐受性至今未見報道。篩選谷氨酸高產菌過程中，抗性平板的應用極其廣泛［3］。分析谷氨酸代謝途徑（圖1），可以選育磺胺胍［4］、酮基丙二酸、丙二酸和香豆素抗性提高的菌株實現高產谷氨酸的目的。其中磺胺胍是ADP磷酸化抑制劑，丙二酸是呼吸鏈抑制劑，對該兩種抑制劑有抗性的突變體，能量代謝得以強化，利于谷氨酸的生產，而為了選育解除谷氨酸對谷氨酸脫氫酶反饋調節的突變株，可通過選育酮基丙二酸抗性實現，香豆素是Vp類衍生物，對其有抗性的菌株細胞膜通透性較好。

表1 不同低pH下九株谷氨酸生產菌的固態條件生長情況

表2 不同低pH下九株谷氨酸生產菌的液態條件生長情況

圖1 谷氨酸發酵的主要代謝途徑

1 材料與方法

1.1 材料與設備

Corynebacterium glutamicum S9114（S9114），Corynebacterium glutamicum ATCC 13761（13761），Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870（13870），Corynebacterium glutamicum ATCC 14067（14067），Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354（15354），Corynebacterium melassecola ATCC 17965（17965），Corynebacterium melassecola ATCC 17966（17966），Corynebacterium glutamicum T613-41（T613-41），Corynebacterium glutamicum T613-85（T613-85）；磺胺胍、酮基丙二酸 購自sigma公司；基本培養基 葡萄糖10g、NaCl 5g、蛋白胨10g、酵母膏5g、牛肉膏10g、瓊脂20g，定容至1L，pH7.0；種子培養基葡萄糖25g、K2HPO41.5g、MgSO40.6g、FeSO45mg、MnSO45mg、尿素2.5g、玉米漿30g，定容至1L，pH7.0；發酵培養基 葡萄糖140g、K2HPO41g、MgSO46g、FeSO45mg、MnSO45mg、硫胺素0.05mg、尿素7g、玉米漿3g，定容至1L，pH7.0；其他試劑 均為國產分析純。

752型紫外可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；SBA-40C型生物傳感分析儀 山東省科學院生物研究所。

1.2 實驗方法

1.2.1 低pH生長特性研究 固態條件：發酵培養基（含2%瓊脂）滅菌后用無菌飽和谷氨酸溶液調節pH至6.0、5.5、5.0、4.5、4.0、3.9、3.8，將九株菌以輻射狀劃線于不同pH固體平板，置于30℃培養箱培養3d，觀察生長情況。

液態條件：將九株菌分別從斜面接種至不同pH（6.0、5.5、5.0、4.5、4.3、4.0）的發酵培養基，30℃，220r/min搖床培養24h，測定發酵液的OD660。

1.2.2 高pH產酸特性研究 發酵培養基（含0.01%溴百里香酚蘭）滅菌后用NaOH調pH至8.0、9.0、10.0、10.3、10.5、11.0，其他同低pH特性相同，分別研究固液兩種條件下的產酸情況。

1.2.3 抗性特性研究 基本培養基（含2%瓊脂）中加入不同濃度抗性制成抗性平板，將九株菌呈輻射狀劃線，30℃培養3d。各種抗性的濃度如下：磺胺胍0.1%、0.2%、0.4%、1%、2%、4%；酮基丙二酸0.25%、0.5%；丙二酸 0.1%、0.2%、0.4%、0.8%、1.6%、3.2%、6.4%；香 豆 素 0.05%、0.1%、0.2%、0.4%。

1.2.4 發酵特性研究 菌株于基本培養基平板活化，接種種子培養基，30℃，220r/min培養8h后，以8%接種量轉接發酵培養基，30℃，220r/min發酵過程中流加尿素維持pH7.0左右，40h后測定發酵液中葡萄糖和谷氨酸含量。

2 結果與討論

2.1 低pH生長特性研究

不同pH的平板于30℃培養3d后，觀察結果如表1。同時計算九株菌搖瓶培養24h后OD660與0h OD660的差值，評判生長與否，結果見表2。

分析表1和表2，固液兩種條件下九株菌的耐受力基本一致，S9114、13761和T613-85的低pH耐受力較強。

2.2 高pH產酸特性研究

溴百里香酚蘭是堿性pH指示劑，其變色范圍是8.0～9.3（黃～藍），在菌體的培養過程中，產生的谷氨酸與NaOH結合使培養基的pH降低而產生變色圈。根據變色圈的大小可以大致衡量菌株的產酸能力。九株菌在pH＜11.0時都能生長，而在pH＞11.0都不能生長，九株菌在高pH生長特性上沒有明顯差別，固體平板上的產酸特性見表3。

表3 不同高pH下九株谷氨酸生產菌的固態條件產酸情況

表4 不同高pH下九株谷氨酸生產菌的液態條件產酸情況

表5 九株菌的磺胺胍耐受性比較

表6 九株菌的酮基丙二酸耐受性比較

表7 九株菌的丙二酸耐受性比較

表8 九株菌的香豆素耐受性比較

在搖瓶中，發酵產酸使發酵液pH降低，當pH低于8.0時發酵液呈黃色，8.0＜pH＜9.3時呈綠色，pH＞9.3呈藍色。從顏色變化可以基本反映出九株菌在高pH條件下的產酸情況，具體見表4。

固液兩種條件，菌體在高pH下產酸的結果沒有矛盾，綜合固液兩種結果，S9114、13870和T613-85表現出了良好的高pH產酸性能。

2.3 抗性特性研究

針對谷氨酸的代謝途徑，選取的4種抗性磺胺胍、酮基丙二酸、丙二酸和香豆素，不同濃度的抗性平板30℃培養3d后，觀察結果，如表5。

通過觀察抗性平板上九株菌的生長情況，得知九株菌對四種抗性的耐受性能有很大區別，耐受能力較強的菌株如下，磺胺胍：S9114；酮基丙二酸：S9114、13870；丙二酸：13761、13870、15354；香豆素：S9114、13870、14067、15354、17965、T613-41、T613-85。

2.4 發酵特性研究

發酵培養基中添加0.01%的中性紅作為pH指示劑，中性紅的變色范圍pH6.8～8.0（紅→黃），發酵過程中，每2h依據發酵液顏色補加適量40%尿素使pH穩定在7.0左右。發酵40h后，將發酵液稀釋100倍，通過SBA-40C生物傳感分析儀測定發酵液中葡萄糖和谷氨酸的含量。結果每批每株菌的發酵液殘糖含量均低于1g/L，可認為糖已經耗完，產酸結果見圖2。九株菌中谷氨酸產量最多的是S9114，且平行性很好。

圖2 九株谷氨酸生產菌發酵產酸量比較

3 結論

九株菌均為革蘭氏陽性，其菌落形態相似，顯微鏡下均為桿狀但長短不一，菌落突起表面光滑，邊緣整齊，但菌落顏色稍有不同。國外學者對該九株谷氨酸生產菌的形態特征、生長情況、肽抗性以及可發酵碳源等有過相關研究，但對pH特性研究不夠詳細，而且未見其考察磺胺胍等抗性［5-13］。實驗中發現菌株在固態和液態條件下的生長等情況基本一致。在pH實驗中，S9114和T613-85的耐受范圍較廣；在抗性和產酸研究中發現，產酸最高的S9114只有在磺胺胍抗性中占有明顯優勢，猜測4種抗性物質中磺胺胍耐受程度與產酸量之間的關系較大。

本實驗通過研究發現S9114的各種特性都略優于其他菌株，因此選取S9114作為出發菌株，進行后續改造實驗，以期能得到更加高產而且具有pH廣域耐受性的優良菌株。由于pH耐受機理不明［14-15］，不能采用定點突變等基因工程手段，本實驗室擬采用X射線誘變以及DES誘變改造S9114，改造后的篩選使用梯度平板［16］以防止漏篩。梯度平板采用發酵培養基，其具體的濃度設計則依據S9114的pH特性，即低pH方向，pH3.9生長，pH3.8不長；高pH方向，pH10.5能夠生長且產酸，pH11.0不能生長，設計低pH梯度平板的兩層pH分別為4.0和3.6，高pH梯度平板的兩層pH分別為10.5和11.2。因為產量一般與抗性之間有一定聯系，所以在pH梯度平板中又加入磺胺胍2%、酮基丙二酸0.25%、丙二酸1.6%和香豆素0.2%，這樣可以在保證抗性的基礎上篩選pH特性提高的菌株。該篩選方法對其他菌的篩選有一定的借鑒作用。

［1］馮志彬，劉進杰，王東陽，等.提高L-谷氨酸產量的后期發酵工藝參數研究［J］.食品科學，2009，30（4）.

［2］于信令.味精工業手冊［M］.北京：中國輕工業出版社，1995.

［3］王帥.L-谷氨酸發酵高產菌選育及其發酵優化的研究［D］.江南大學發酵工程，2008.

［4］王東陽.谷氨酸高產菌的原生質體誘變育種及其發酵條件研究［D］.天津科技大學輕工技術與工程，2005.

［5］Shukuo Kinoshita，Katsunobu Tanaka，Shigezo Udaka，et al. Microbiological production of amino acid by reductive amination［P］.US 3，220，929，1965-11-30.

［6］Hirotoshi Samejima，Hiroshi Teranishi，Takashi Deguchi，et al.Process for extracting proteins from Microorganisms［P］.US 3，585，179，1971-06-15.

［7］Isamu Shiio，Koji Mitsugi，Shinichiro Otsuka，et al.Process for producing L-glutamic acid［P］.US 3，117，915，1964-01-14.

［8］Takayasu Tsuchida，Hatuo Uchibori，Hiroshi Takeuchi，et al. Process for producing L-amino acids by fermentation［P］.US 5，705，370，1998-01-06.

［9］Shinichi Motozaki，Toshinao Tsunoda，Shinji Okumura，et al. Process for producing L-glutamic acid［P］.US 3，096，252，1963 -07-02.

［10］ Kenzo Yokozeki，KojiKubota.Method ofproducing L-carnitine［P］.US 4，650，759，1987-03-17.

［11］Sotoo Yamamoto，Tetsukazu Goto，Takeyoshi Ohsawa，et al. Method for production of L-glutamic acid by microbacteria［P］. US 3，338，793，1967-08-29.

［12］ Takeyoshi Ohsawa， Mitsuru Shibukawa， Hideomi Takahashi，et al.Process for producing L-glutamic acid by using bacteria［P］.US 3，399，114，1968-08-27.

［13］Tetsukazu Goto，Shuichi Nishio，Hiroshige Kojima，et al. Process for producing L-glutamic acid by using Corynebacterium Melassecola［P］.US 3，355，359，1967-11-28.

［14］Terry Ann Krulwich.Alkaliphiles：‘ basic’molecular problems of pH tolerance and bioenergetics［J］.Molecular Microbiology，1995 15（3）：403-410.

［15］Yuhua Wang，Yan Li，Xiaolin Pei，et al.Genome-shuffing improved acid tolerance and l-lactic acid volumetric productivity in Lactobacillus rhamnosus［J］.Journal of Biotechnology，2007，129：510-515.

［16］Ranjan Patnaik，Susan Louie，Vesna Gavrilovic，et al. Genome shuffling of Lactobacillus for improved acid tolerance［J］. Nature Biotechnology，2002，20.

Biological characteristics of nine glutamate acid-producing bacteria

DU Qiao-yan1，ZHENG Pu1，*，SUN Zhi-hao1，HE Yi-qing2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education and School of Biotechnology Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Life Sciences&Chemical Technology，Ngee Ann Polytechnic，Singapore S599489）

【Objective】Biological characters of 9 strains of glutamic acid bacteria were investigated to provide experimental support for screening of high glutamate acid-producing bacteria with a wide range of pH tolerance.【Method】The acid production and the tolerance of the nine strains to low pH，high pH，sulfaguanidine，diethyl ketomalonate，malonicacid and coumarinwerestudied.【Result】Corynebacterium glutamicum S9114，Corynebacterium glutamicum ATCC 13761 and Corynebacterium glutamicum T613-85 had higher tolerance under low pH（pH3.9）.S9114，Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870 and T613-85 could product glutamate acid at pH 10.5.Growth on the resistance plate showed the growth advantage of certain strains as follows：sulfaguanidine：S9114，diethyl ketomalonate：S9114and 13870，malonic acid：Corynebacterium glutamicum ATCC13761，ATCC13870 and Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354，coumarin：all except 13761 and Corynebacterium melassecola ATCC 17966.S9114 had the highest yield of glutamate acid【.Conclusion】Taking S9114 as the original strain to modify followed with the high or low pH，gradient screening plates consist of sulfaguanidine 2%，diethyl ketomalonate 0.25%，malonic acid 1.6%and coumarin 0.2%.

glutamate acid-producing bacteria；pH；resistance；acid production

TS201.2

A

1002-0306（2010）12-0185-04

2009-07-09 *通訊聯系人

杜巧燕（1987-），女，碩士研究生，研究方向：生物化工。

國家高技術研究發展計劃（“863”計劃）重點項目（2006AA020301）。