魷魚骨殼聚糖的抑菌性能研究

姜啟興，烏 德，趙黎明，鄒玉萍，于沛沛，夏文水，*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院食品科學(xué)與工程系，上海200237）

魷魚骨殼聚糖的抑菌性能研究

姜啟興1，烏 德1，趙黎明2，鄒玉萍1，于沛沛1，夏文水1，*

（1.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫214122；2.華東理工大學(xué)生物工程學(xué)院食品科學(xué)與工程系，上海200237）

研究了魷魚骨殼聚糖對食品中常見微生物的抑制作用，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉等為受試菌，研究了2種不同相對分子量的魷魚骨殼聚糖（1210、844kD）的抑菌性能，并探討了殼聚糖抑菌作用的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，兩種殼聚糖對四種菌都有明顯的抑制作用，相應(yīng)最小抑菌濃度對大腸桿菌為0.02%，對金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉均為0.05%，殼聚糖的抑菌作用具有良好的熱穩(wěn)定性。

魷魚骨殼聚糖，抑菌作用，穩(wěn)定性

殼聚糖是一種由甲殼素脫乙酰化得到的堿性陽離子多糖，其分子表現(xiàn)出多種獨(dú)特的生物活性和功能，已在醫(yī)學(xué)、食品和化工等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用［1-3］。不同甲殼素根據(jù)結(jié)構(gòu)可分為三大類，即：從蟹蝦殼中提取的α-甲殼素，從海洋軟體動(dòng)物骨骼中提取的β-甲殼素，從昆蟲外殼中提取的 γ-甲殼素［4］。甲殼素經(jīng)脫乙?；蠹吹玫綒ぞ厶恰Ｄ壳埃P(guān)于殼聚糖的報(bào)道大多數(shù)都是關(guān)于來源于蝦蟹殼的α-殼聚糖的報(bào)道，而關(guān)于β-殼聚糖的報(bào)道很少。β-殼聚糖其分子鏈為平行排列，有別于蝦蟹殼制成的α-型的逆平行排列，一般認(rèn)為β-殼聚糖具有較高的生化活性，而α-型的分子結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)主要是在前期提取得到的魷魚骨殼聚糖（一種β-殼聚糖）的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究其抑菌能力，為它將來的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

魷魚骨殼聚糖 C1：脫乙酰度90%、分子量1210kDa；C2：脫乙酰度90%、分子量844kDa，自制；金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、黑霉菌、啤酒酵母 均由江南大學(xué)食品學(xué)院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室提供；冰醋酸、NaCl、葡萄糖等 均為分析純；牛肉浸膏、蛋白胨、酵母膏、瓊脂 生化試劑。

SPX型智能生化培養(yǎng)箱 南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；CRDX-280手提式滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；WHZ UV-2100紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；電子精密天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對細(xì)菌生長抑制曲線的測定 稱取一定量的魷魚骨殼聚糖，用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基將其稀釋成為某一濃度，調(diào)整pH為7.0，接入1mL的細(xì)菌菌種液，以不加殼聚糖的肉湯培養(yǎng)基混合液作為空白對照，置于37℃下恒溫振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣測定其吸光度值，用吸光度值的變化反映濁度的變化，即細(xì)菌數(shù)量的變化［4-8］。

1.2.2 對酵母生長抑制曲線的測定 稱取一定量的魷魚骨殼聚糖，用土豆培養(yǎng)基將其稀釋成為某一濃度，調(diào)整pH為7.0，接入1mL的啤酒酵母菌液，以不加殼聚糖的土豆培養(yǎng)基混合液作為空白對照，置于28℃下恒溫振蕩培養(yǎng)，定時(shí)取樣測定其吸光度值。

1.2.3 對霉菌生長抑制曲線的測定 稱取一定量的魷魚骨殼聚糖，用土豆培養(yǎng)基將其稀釋成為某一濃度（最低抑菌濃度），調(diào)整pH為7.0，接入1mL的黑曲霉孢子懸浮液，置于30℃下恒溫培養(yǎng)，定時(shí)取樣，用布氏漏斗抽濾。收集菌絲體，洗凈，置烘箱中烘干后稱重。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）的測定 采用瓊脂稀釋法。選取抑菌能力較好的魷魚骨殼聚糖進(jìn)行最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)，用2倍稀釋法配制得到各種濃度魷魚骨殼聚糖溶液，分別用無菌吸管定量將該溶液加入至已滅菌的培養(yǎng)皿中，然后分別加入一定體積已熔化并降溫至45℃的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基或麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基中，搖勻，倒平板，加入 0.1mL含菌量為107CFU/mL的菌懸液，涂布。細(xì)菌在37℃恒溫倒置培養(yǎng)24h，霉菌和酵母在28℃恒溫倒置培養(yǎng)48h，無菌生長的培養(yǎng)皿中防腐劑的最低濃度即為防腐劑的最低抑菌濃度（MIC）［8］。

1.2.5 加熱溫度對魷魚骨殼聚糖抗菌活性的影響魷魚骨殼聚糖溶液，予以 121℃、15min，100℃、15min，80℃、15min處理，用平板稀釋法測定魷魚骨殼聚糖經(jīng)不同溫度處理后的抑菌率，以未經(jīng)熱處理的殼聚糖抑菌率為100%，計(jì)算相對抑菌率。其中魷魚骨殼聚糖的濃度為各種菌的最低抑菌濃度［9］。

2 結(jié)果與討論

2.1 對大腸桿菌的生長抑制實(shí)驗(yàn)

以大腸桿菌為對象菌，研究了魷魚骨殼聚糖對其的抑制效果，圖1是兩種不同分子量的魷魚骨殼聚糖C1、C2對大腸桿菌的生長抑制曲線圖。

圖1 魷魚骨殼聚糖抑制大腸桿菌的生長曲線

從圖1中看出，兩種魷魚骨殼聚糖在濃度相同的情況下，C1能完全抑制大腸桿菌的生長，即使培養(yǎng)了40h后，其培養(yǎng)基的OD值仍低于0.2。C1和C2對大腸桿菌的生長抑制曲線的最大差別出現(xiàn)在延滯期，但最終在穩(wěn)定期重合，說明C1比C2更能延長大腸桿菌對數(shù)生長期的到來，但抑制大腸桿菌總數(shù)的能力等同于C2。

2.2 對金黃色葡萄球菌的抑制

以金黃色葡萄球菌為對象菌，研究了魷魚骨殼聚糖對其的抑制效果，圖2是兩種不同分子量的魷魚骨殼聚糖C1、C2對金黃色葡萄球菌的生長抑制曲線圖。

圖2 魷魚骨殼聚糖抑制金黃色葡萄球菌的生長曲線

從圖2中可以看出，兩種魷魚骨殼聚糖均對金黃色葡萄球菌有較好的抑制效果，在實(shí)驗(yàn)濃度條件下，魷魚骨殼聚糖可顯著延長其延滯期，且分子量較大的C1比C2抑制效果更顯著。

2.3 對啤酒酵母的抑制作用

以啤酒酵母為對象菌，研究了魷魚骨殼聚糖對其的抑制效果，圖3是兩種不同分子量的魷魚骨殼聚糖C1、C2對啤酒酵母的生長抑制曲線圖。

圖3 魷魚骨殼聚糖抑制啤酒酵母的生長曲線

從圖3中可以看出，兩種魷魚骨殼聚糖均對啤酒酵母有較好的抑制效果，在實(shí)驗(yàn)濃度條件下，魷魚骨殼聚糖可顯著延長其延滯期的作用，且分子量較大的C1比C2抑制效果更顯著。

2.4 對黑曲霉的抑制作用

以黑曲霉為對象菌，研究了魷魚骨殼聚糖對其的抑制效果，圖4是兩種不同分子量的魷魚骨殼聚糖C1、C2對黑曲霉的生長抑制曲線圖。

圖4 魷魚骨殼聚糖抑制黑曲霉的生長曲線

從圖4中看出兩種魷魚骨殼聚糖在濃度相同的情況下，C1、C2均能顯著延長黑曲霉的延滯期，即使培養(yǎng)了40h后，其培養(yǎng)基的OD值仍低于0.2。相對分子質(zhì)量較大的C1的抑菌效果略好于C2。

從圖1～圖4中可以很明顯地看出，兩種不同分子量的魷魚骨殼聚糖對四種微生物均有一定的抑制能力，但C1（1210kDa）的抑菌能力要明顯高于C2（844kDa），但也有很多研究表明，在某一分子量范圍內(nèi)，殼聚糖的分子量越小其抑菌能力越大，所以要揭示殼聚糖的抑菌能力與分子量的關(guān)系，則需要進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

2.5 最低抑菌濃度

最低抑菌濃度是描述抑菌能力的一個(gè)指標(biāo)，魷魚骨殼聚糖的濃度在抑制微生物能力方面扮演著一個(gè)重要的角色，表1是魷魚骨殼聚糖C1在不同濃度下的抑菌情況。

表1 不同濃度魷魚骨殼聚糖C1的抑菌率（%）

從表1可以看出，魷魚骨殼聚糖C1對實(shí)驗(yàn)中用到的各種細(xì)菌、酵母和霉菌的抑制能力都很好，當(dāng)殼聚糖的濃度只有0.001%時(shí)，也能很好地抑制大腸桿菌的生長，但對其他微生物的抑制效果卻不太理想，其抑菌效率都低于20%。從以上數(shù)據(jù)可以看出，魷魚骨殼聚糖對革蘭氏陰性菌的抑制能力大于對革蘭氏陽性菌的抑制能力，其次是黑曲霉，而對啤酒酵母的抑制能力最低，說明殼聚糖對細(xì)菌的抑制能力強(qiáng)于對真菌的抑制能力。

在所實(shí)驗(yàn)的pH條件下，魷魚骨殼聚糖C1對革蘭氏陰性菌大腸桿菌的最低抑菌濃度為0.02%，對啤酒酵母、黑曲霉等真菌以及革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度均為0.05%。

2.6 熱處理對魷魚骨殼聚糖抑菌能力的影響

加熱是食品保藏的重要方法，防腐劑作用的發(fā)揮與溫度有協(xié)同作用，在防腐劑存在下殺死微生物所要求的溫度比沒有防腐劑存在時(shí)低得多，即在低于微生物失活的加熱溫度下，可增加微生物對于一些防腐劑的敏感性。但是有些防腐劑熱穩(wěn)定性很差，熱處理往往會使其降解或發(fā)生反應(yīng)，影響防腐劑的抑菌效果。因此，研究熱處理對魷魚骨殼聚糖抑菌能力的影響具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義，結(jié)果如表2。

表2 熱處理對魷魚骨殼聚糖抑菌能力的影響（%）

從表2可以看出，熱處理對魷魚骨殼聚糖的抑菌能力影響較小，經(jīng)處理后相對抑菌率均保持在88%以上，且隨著處理強(qiáng)度的降低（溫度降低），對抑菌能力的影響逐漸減少。經(jīng)熱處理后對不同微生物的抑菌能力的影響有所不同，相對而言，殼聚糖經(jīng)熱處理后對大腸桿菌的抑制能力變化不大，即使121℃處理15min其相對抑菌率仍能達(dá)到95%以上；而對于金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉，熱處理對于殼聚糖抑菌能力的影響相對較大，經(jīng)121℃處理15min相對不熱處理的抑菌能力下降了11%左右。但是對于80℃處理15min這種程度的熱處理對魷魚骨殼聚糖的抑菌能力影響很小，最多也只下降了5%，這也就有力地說明了此種殼聚糖可以很好地應(yīng)用到果汁、牛奶等巴氏殺菌的食品中防腐。

3 結(jié)論

3.1 從魷魚骨中提取的殼聚糖能很好地抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉的生長，且殼聚糖 C1（1210kDa）的抑菌能力比殼聚糖 C2（844kDa）強(qiáng)。

3.2 魷魚骨殼聚糖C1對于大腸桿菌的最低抑菌濃度是0.02%，對于金黃色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉的最低抑菌濃度均為0.05%。

3.3 熱處理對魷魚骨殼聚糖的抑菌能力影響較小，可應(yīng)用到果汁、牛奶等巴氏殺菌的食品中。

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Study on antimicrobial activity of squid pens chitosan

JIANG Qi-xing1，OULD Mohamed Dadda1，ZHAO Li-ping2，ZOU Yu-ping1，YU Pei-pei1，XIA Wen-shui1，*
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Department of Food Science& Technology，School of Biotechnology，East China University of Science&Technology，Shanghai 200237，China）

The antimicrobial activity of squid pens chitosan with different molecular weigh（t1210，844kD）and same deacelylated degree（90%），was evaluated against some bacteria（Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Aspergillum niger，and Saccharomyces cerevisiae）.The results showed that chitosans treatments could inhibit the growth of all the bacteria tested，and the inhibiting rate increased with the rising of chitosan’s molecular weight.The minimum inhibitory concentration of the chitosan（1210kD）was 0.02%to Escherichia coli，0.05%to other three kinds of microorganism.ln the meanwhile the effects of temperature on the antibiotic activity of chitosan（1210kD）were also assessed.lt showed that the chitosan had a good thermostability，which made it have a good anticorrosive application in fruit juice，milk only need pasteurization.

squid pens chitosans；antibiotic activity；stability

TS254.1

A

1002-0306（2010）12-0094-03

2010-01-18 *通訊聯(lián)系人

姜啟興（1977-），男，博士研究生，講師，研究方向：食品加工與保藏。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863）項(xiàng)目（2006AA09Z444）；廣東省教育部產(chǎn)學(xué)研結(jié)合項(xiàng)目（2007A090302059）。