普洱茶(熟茶)中主要霉菌的分離與鑒定

許靖逸，邵宛芳，*，張 俊，王文光，袁 唯

（1.云南農業大學龍潤普洱茶學院，云南昆明650201；2.云南省農業科學院，云南昆明650000；3.云南農業大學食品科技學院，云南昆明650201）

普洱茶(熟茶)中主要霉菌的分離與鑒定

許靖逸1，邵宛芳1，*，張 俊2，王文光3，袁 唯3

（1.云南農業大學龍潤普洱茶學院，云南昆明650201；2.云南省農業科學院，云南昆明650000；3.云南農業大學食品科技學院，云南昆明650201）

“渥堆”過程和貯藏工藝是普洱茶具有獨特品質的主要原因，而“渥堆”過程中微生物發揮了重要作用。本實驗對云南省普洱茶主產區的普洱熟茶中的主要霉菌進行分離鑒定，旨在探討普洱熟茶中主要的霉菌種類。

普洱茶，霉菌，分離，鑒定

根據GB/T 22111規定，普洱茶是指以地理標志保護范圍內的云南大葉種曬青茶為原料，并在地理標志保護范圍內采用特定的加工工藝制成，具有獨特品質特征的茶葉。按其加工工藝及品質特征，普洱茶分為普洱茶（生茶）和普洱茶（熟茶）兩種類型。在普洱茶（熟茶）的加工過程中，要以云南大葉種制成的曬青毛茶作為原料，經過潮水、后發酵、陳化及干燥工序。普洱茶品質形成是原料、加工工藝、加工環境條件等綜合作用的結果，其中渥堆是一道最為關鍵的工序，根據陳宗道［1］研究發現，普洱茶渥堆過程中存在黑曲霉、青霉、根霉、灰綠曲霉、酵母等微生物，黑曲霉約占微生物總數的80%左右。胡建程［2-3］等先后在各種再加工茶中分離鑒定出青霉（Penicllium）、曲霉（Aspergillius）、毛霉（Mucor）、根霉（Rhizopus）、蠟中枝孢霉（Cladosprium）等。研究發現即使在普洱成品茶中這些微生物還存在，對普洱茶品質的形成始終都起到了相當重要的作用。本研究以云南普洱茶主產區生產的普洱熟茶為材料，對其中的霉菌進行分離鑒定，旨在探討普洱熟茶中主要的霉菌種類，為消費者放心飲用普洱茶提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

以云南普洱茶主產區中主要廠家生產的普洱熟茶（散茶和餅茶）為供試材料 所選樣品均具有普洱茶（熟茶）正常的品質特征。具體情況見表1；培養基分離曲霉類（PDA培養基）、黑曲霉屬純化培養基。

表1 供試材料表

SW-CJ-IA型超凈工作臺，BII.500-S型電熱恒溫培養箱，S.C.101-1型鼓風電熱干燥箱，A13204-N型電子分析天平，JLQ-SI型菌落計數器，HZQ-QX型全溫振蕩器，OLYMPUS型顯微鏡，Motic-AE31型顯微攝影用倒置顯微鏡，高壓濕熱蒸汽滅菌鍋，粉碎機組織搗碎機，顯微鏡SONY數碼照相機，細菌生化微量鑒定管，冰箱，微波爐等。

1.2 實驗方法

霉菌的分離與計數選用孟加拉紅培養基；樣品稀釋液的制備［4］；接種［5］；選菌及純化［6］；載片培養；顯微觀察及顯微攝影；霉菌的鑒定主要通過菌落特征、顯微形態觀察和顯微測微尺法進行測量鑒定，結合《真菌鑒定手冊》［6］。

2 結果與分析

2.1 普洱茶樣中霉菌及其優勢菌的數量差異

普洱茶后發酵過程中，霉菌對其品質的形成起到很大作用。普洱茶產品特別是壓制茶，經過篩分和高溫蒸壓后，殘留在其中的霉菌數量很少。本實驗采用25℃無菌水進行處理，用孟加拉紅培養基對普洱茶產品中殘留的霉菌及其優勢菌進行分離計數，其結果見圖1、圖2。

圖1 25℃水溫處理普洱餅茶中霉菌數量

圖1和圖2表示經室溫水處理的餅茶散茶中霉菌及其優勢霉菌的數量差異，由圖1和圖2可知，普洱茶中霉菌數量較少，僅達102個/g，餅茶中霉菌的數量極少，且以6號茶和7號茶即思茅地區生產的普洱茶中霉菌的數量居多；散茶中的霉菌可達104個/g，其數量是餅茶中的100倍左右，可能是由于加工工藝或生產環境的不同造成普洱茶中微生物數量的差異。散茶中，尤其是9號茶中霉菌的數量較少。

2.2 普洱茶樣中霉菌的鑒定

在16份普洱茶樣品中，共分離純化得到5株霉菌類菌株，經形態及培養特征、生理生化反應觀察，依據《真菌鑒定手冊》［6］、《中國真菌志》［7］，并經真菌學專家劉云龍驗證，鑒定結果如下：

2.2.1 青霉屬（Penicillium） 按照《真菌鑒定手冊》［6］和《中國真菌志》［7］的方法對該菌進行初步鑒定，結果如圖3～圖5所示。

菌落形態：生長速度一般，絨狀，菌落近似圓形，初為白色，隨著不斷的生長逐漸變成淺藍色，后變為藍綠色至灰綠色，邊緣為白色環狀，有淺黃色液滴，背面變為無色至淺黃色，有皺褶。

圖3 單菌落

圖5 分生孢子（×600）

個體形態：帚狀枝有分枝1～2次，不對稱，小梗不作批針狀，不分散，分枝緊湊，分枝與間枝近似于平行排列，孢子鏈分開，小梗頂端驟然變細削，分生孢子有球形、圓柱形、橢圓形等多種形態。

該菌的分類地位為真菌門（Fungi），半知菌類（Fungi Imperfect），從梗孢目（Moniliales），從梗孢科（Moniliaceae），從梗孢科單孢亞科（Amerosporoideae of Monilliaceae），曲 霉 族（ Aspergilleae），青 霉 屬（Penicillium LK.ex Fries）［8］。該種青霉能產生檸檬酸霉素［9-11］，對普洱茶醇和品質的形成具有一定的作用［12］。

2.2.2 曲霉屬（Aspergillus）

2.2.2.1 Aspergillus 01 按照《真菌鑒定手冊》［6］和《中國真菌志》［7］的方法對Aspergillus 01進行初步鑒定，結果如圖6～圖8所示。

圖6 單菌落

圖7 產孢結構（×600）

圖8 分生孢子（×600）

菌落形態：該菌在PDA培養基上生長旺盛，菌落初生為乳白色，后中心變為淺藍色，最后變成青綠色，似青霉。菌落表面呈絨毛狀，邊緣為白色，背面變為淺黃色。在28～30℃下培養3～4d，直徑可長到3.0～4.0cm左右大小。

個體形態：分生孢子梗頂端膨大呈燒瓶形或近圓形的囊狀，其梗徑5～8μm，其上著生有雙層小梗，孢子穗為圓球形，直徑100～150μm，分生孢子為球形，直徑2.5～3.5μm。

該霉菌的分類地位為真菌門（Fungi），半知菌類（Fungi Imperfect），叢梗孢目（Moniliales），從梗孢科（Moniliaceae），從梗孢科單胞亞科（Amerosporoideae of Monilliaceae），曲 霉 族（ Aspergilleae），曲 霉 屬（Aspergillus Micheli ex Fr），薩氏曲霉組（A.sydowi）。該菌對普洱茶呈香起重要作用。

2.2.2.2 Aspergillus02 按照《真菌鑒定手冊》［6］和《中國真菌志》［7］的方法對該菌進行初步鑒定，結果如圖9～圖13所示。

圖9 產孢結構（×600）

菌落形態：菌落在PDA培養基上生長迅速，在28～30℃下培養7d，菌落鋪滿整個平板；菌落平坦或中心稍凸起，有規則或不規則的輻射狀溝紋，質地絲絨狀或稍呈絮狀，有的偶有過度生長，表面呈暗褐色至炭黑色，滲出液有或無，具或不具霉味；在平面培養基上生于中央，在斜面培養基上生于基部，菌落反面無色、黃色、黃褐色或帶微黃色。

個體形態：分生孢子結構大，呈黑褐色至炭褐色，分生孢子頭初為球形至輻射狀，直徑 150～470mm，老后分裂成幾個圓柱形，可達780mm左右，有的菌株產生菌核。孢梗莖1500μm×9～20μm，壁光滑，老時帶黃色或黃褐色；頂囊球形或近球形，老時暗褐色。

圖10 分生孢子梗（×150）

圖11 分生孢子（×600）

圖12 俯視分生孢子頭（×150）

圖13 單菌落

該霉菌的分類地位為真菌門（Fungi），半知菌類（Fungi Imperfect），叢梗孢目（Moniliales），從梗孢科（Moniliaceae），從梗孢科單胞亞科（Amerosporoideae of Monilliaceae），曲 霉 族（ Aspergilleae），曲 霉 屬（Aspergillus Micheli ex Fr），黑曲霉組（A.niger）［8］。

該菌是一種食品工業生產中的安全性菌群，是參與普洱茶品質形成的主要菌種，在生產中具有重要經濟意義［13］。黑曲霉能產生20種左右的水解酶，其中糖苷酶、果酸酶、葡萄糖淀粉酶、纖維素酶、柚苷酶、乳酸酶、葡萄糖氧化酶等許多酶類，還可以分解包括多糖、脂肪、蛋白質、果膠、天然纖維和不可溶性化合物等有機物；并且它的異變菌可產生草酸、檸檬酸、葡萄糖酸、抗壞血酸等。在普洱茶渥堆發酵陳化中，黑曲霉代謝產生的有機酸和酶等對普洱茶品質的形成起著重要的作用。

其產生的葡萄糖淀粉酶、纖維素酶和果膠酶等可以分解包括多糖、脂肪、蛋白質、天然纖維、果膠和不可溶性水化合物等有機物，水解的產物大多為單糖、氨基酸、水化果膠和可溶性碳水化合物，使茶葉內所含有效成分易于滲出、擴散，為增強茶湯的滋味和形成普洱茶甘滑、醇厚的品質特色奠定了堅實的物質基礎。所以說，在普洱茶發酵渥堆過程中黑曲霉代謝產生的有機酸和酶對普洱茶品質的形成有著重要作用。

2.2.2.3 Aspergillus03 從成品普洱茶中分離出的菌體顯微照相見圖14～圖17所示。

圖14 幼時菌落

圖15 成熟菌落

圖16 產孢結構（×600）

圖17 分生孢子（×600）

菌落形態：菌落初呈黃色或淡黃綠色，后變黃褐色；在PDA培養基上生長速度一般，質地粉粒狀或絨狀；培養基背面無色至淡黃色，無滲出液，有或無霉味。

個體形態：分生孢子圓形或洋梨形，直徑4～10μm，粗糙；分生孢子梗長達 2mm，直徑20～25μm，壁薄粗糙；頂囊直徑50～70μm，小梗單層或雙層。

該霉菌屬于真菌門（Fungi），半知菌類（Fungi Imperfect），叢 梗 孢 目（Moniliales），從 梗 孢 科（Moniliaceae），從梗孢科單胞亞科（Amerosporoideae of Monilliaceae），曲 霉 族（ Aspergilleae），曲 霉 屬（Aspergillus Micheli ex Fr），黃-米曲霉組（A.flavusoryze）［14］。

本種在工業上用途很廣，主要是釀造酒精、味精和醬油；也可用于生產α-乳酸和糊化淀粉，對普洱茶回甘及陳香風味有一定影響。

2.2.3 毛霉目（Mucoraceae） 從成品普洱茶中共分離到2株毛霉目霉菌菌株，其鑒定結果如下：

2.2.3.1 根霉（Rhizopus） 按照《真菌鑒定手冊》［6］和《中國真菌志》［7］的方法進行初步鑒定，結果如圖18～圖20所示。

圖18 黑根霉菌叢

圖19 黑根霉形態（×150）

圖20 黑根霉假根（×600）

菌落形態：該菌在PDA培養基上生長時，初呈白色，絨毛狀，匍匐菌絲彎曲狀，在與培養基表面相接觸處產生假根，假根發達，分枝多，兩接間距離大約為1～2μm。

個體形態：孢梗直立不分枝，孢子囊球形或橢圓形，褐色或黑色，囊軸球形、橢圓形，直徑約為55μm，高約70μm。

經鑒定，該菌屬于接合菌亞門（Zygomycotina）；接合菌綱（Zygomycetes）；毛霉目（Mucorales）；毛霉科（Mucoraceae），根霉屬（Rhizopus Ehrenberg），黑根霉（Rhizopus nigricans）。

除了細菌以外，黑根霉是迄今為止絲狀菌中產L-乳酸的另一重要菌種［15-16］，黑根霉淀粉酶的活力很高，能產生有機酸，如反丁烯二酸、乳酸、琥珀酸等，還能產生芳香的酯類物質，也是轉化甾醇族化合物的重要菌類，在普洱茶加工儲放過程中生成一定數量的根霉，有利于普洱茶甜醇品質的形成。

2.2.3.2 毛霉（Mucor） 按照《真菌鑒定手冊》［6］和《中國真菌志》［7］的方法對該菌進行初步鑒定，結果如圖21～圖23所示。

圖21 毛霉菌叢

圖22 毛霉孢子囊的著生（×600）

圖23 毛霉形態（×600）

菌落形態：通常菌絲體發達，分枝成蛛網狀，多核、無隔，氣生菌絲體往往生長繁茂，呈毛狀，毛霉的菌絲體在基質上或基質內能廣泛蔓延，無假根和匍匐枝，生長速度很快，28～30℃下2d，菌落可以擴展整個平板。

個體形態：孢囊梗直接由菌絲體生出，一般單生，分枝較少或不分枝。分枝頂端都有膨大的孢子囊，囊軸與孢囊梗相連處無囊托。孢囊孢子成熟后，孢子囊壁破裂，孢囊孢子分散開來。毛霉菌絲初期為白色，后為灰白色至黑色，這說明孢子囊大量成熟。

該菌的分類地位為接合菌亞門（Zygomycotina）；接合菌綱（Zygomycetes）；毛霉目（Mucorales）；毛霉科（Mucoraceae）；毛霉屬（Mucor Micheli ex Fries）；總狀枝毛霉組（Racemosus）［17］。該菌分布很廣，是制造豆鼓的發酵菌之一，也是普洱茶發酵菌株之一。

3 結論

3.1 普洱茶中微生物含量很少，尤其是霉菌含量較少，僅達102個/g，餅茶中霉菌的數量更少。

3.2 本實驗從普洱茶樣中分離到3株曲霉，其中一株是黑曲霉、青霉、根霉和毛霉各1株，這些均為食品發酵工業常用的菌種。

綜上所述，普洱茶中所存在霉菌主要是一些青霉、曲霉等有益菌群，沒有發現對人體產生危害作用的微生物，本研究結果將對消費者放心飲用普洱茶提供理論依據。

［1］陳宗道，劉勤晉，周才瓊.微生物與普洱茶發酵［J］.中國茶葉，1988（4）：4-7.

［2］胡建程.四種邊茶中微生物分離和鑒定［J］.茶葉，1957（2）：20-22.

［3］胡建程.茶葉中霉菌的研究［J］.茶葉，1979（1）：8-9.

［4］譚自立.茶和普洱茶的保健作用［J］.云南茶葉，1994（3）：4-6.

［5］鄧時海.普洱茶作為人體健康食療的探討（四）［J］.云南茶葉，1996（1）：19-21.

［6］魏景超.真菌鑒定手冊［M］.上海：上?？茖W技術出版社，1979：1-649.

［7］齊祖同.中國真菌志［M］.第一版，第五卷.北京：科學出版社，1997：1-178.

［8］C J阿歷索保羅，C W明斯.真菌學概論［M］.北京：農業出版社，1981：1-2，247-256.

［9］謝舜珍，張樹正.局限青霉生淀粉水解酶的產生條件及酶一般性質的研究［J］.微生物學報，1994，34（3）：263-238.

［10］Fierro F，Laich F，Garcia-Rico RO，et al.High efficiency transformation of Peniculium nalgiovense with integrative and autonomously replicating plasmids［J］.Int J Food Microbiol，2004，90（2）：237-248.

［11］Alberto Martin，Juan J Cordoba，Maria J Benito.Effect of Penicillium chryso-genum and Debaryomyces hansenii on the volatile compounds during controlled ripening of pork loins［J］. International Journal of Food Microbiolo，2003，841：327-338.

［12］周樹紅.成品普洱茶陳化機理及提質技術研究［D］.優秀碩博論文，2001：1-2.

［13］余永華.真菌與人［M］.北京：科學普及出版社，1979：84-94.

［14］蘇世彥.食品微生物檢驗手冊［M］.第一版.北京：中國輕工業出版社，1998.

［15］曹本昌，徐建林，匡群.根霉發酵L-乳酸［J］.食品與發酵工業，1991（1）：37-41.

［16］Catter V M.Nuclear behavior in the Mucorales I.The Mucor pattem［J］.Bull Torry Bot，Club，1942，69：480-508.

［17］張紀忠.微生物分類學［M］.上海：復旦大學出版社，380-384.

Isolation and identification of the main fungus from pu-erh tea

XU Jing-yi1，SHAO Wan-fang1，*，ZHANG Jun2，WANG Wen-guang3，YUAN Wei3
（1.College of Long Run Pu-erh Tea，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China；2.Yunnan Academy of Agricultural Science，Kunming 650000，China；3.College of Food Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China）

The main reasons of forming unique quality are pile-fermentation process and storage technology in puerh tea.Moreover，microbes play a very important role during the pile-fermentation.The isolation and identification of fungus from pu-erh tea which had been picked from main pu-erh tea producing areas in Yunnan province were carried out to confer which fungus were in pu-erh tea.

pu-erh tea；fungus；isolation；identification

TS272.5+9

A

1002-0306（2010）12-0110-05

2009-02-04 *通訊聯系人

許靖逸（1980-），女，博士，主要從事茶葉生物技術與資源利用研究。

農業部公益性行業科研專項（nyhyzx3-35-14）；現代農業（茶葉）產業技術體系建設專項資金資助。