預處理方式對酶修飾大豆分離蛋白水解程度的影響

齊蓮子，遲玉杰

（1.東北農業大學食品科學學院，黑龍江哈爾濱150030；2.大豆生物學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030）

預處理方式對酶修飾大豆分離蛋白水解程度的影響

齊蓮子1，遲玉杰2，*

（1.東北農業大學食品科學學院，黑龍江哈爾濱150030；2.大豆生物學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱150030）

研究微波輻照、加熱處理、高速剪切三種預處理方式對大豆分離蛋白酶修飾產物水解程度的影響。以水解度、溶解性為指標進行綜合評價，揭示水解度與溶解性的關系。結果顯示，與空白對照相比較，三種預處理方式均能提高酶修飾產物的水解度和溶解性，溶解性隨水解度的增加而增加。在底物濃度10%，溫度50℃，酶添加量0.50%條件下，水解度分別提高了2.43倍、2.87倍和3.19倍，蛋白粉溶解性提高了1.65倍、1.76倍、2.23倍。其中，高速剪切預處理對大豆分離蛋白酶修飾水解度和溶解性增加尤為顯著。與傳統酶修飾方法相比，本實驗將酶修飾時間由4.5h縮減至2.0h，提高了反應效率。

大豆分離蛋白，水解度，微波輻照，加熱處理，高速剪切

大豆分離蛋白（SPI）具有溶解性、乳化性、凝膠性等多種功能特性，廣泛應用于食品中［1］。蛋白質強化酸性飲料因口感獨特和營養豐富逐漸被人們所青睞，其pH在4.0～5.0［2］范圍內，而在此pH范圍內SPI溶解性差，限制了其添加量和使用范圍，因此需有針對性地提高SPI在此范圍內的溶解性，拓寬其應用。酶修飾作用條件溫和，專一性強，產品安全性高，通過部分降解蛋白質增加其分子內或分子間交聯或連接特殊功能基因，改變其功能性質［3］。許多學者［4-7］利用蛋白酶對大豆蛋白進行修飾，并對提高其溶解性進行了探討。B.P.Lamsal［8］等利用菠蘿蛋白酶對SPI進行修飾，水解度（DH）為4%時，pH4.0條件下的溶解性近40%。但以上研究中，大多在較長水解周期、較高酶添加量條件下，利用預熱處理對較低底物濃度的大豆蛋白進行酶修飾，最終溶解性有所提高。而針對高底物濃度、低酶添加量對SPI進行酶修飾，研究酶修飾SPI在等電點處溶解性的報道比較少。原因可能在于：10%（W/V）含量的SPI溶液經加熱會凝固產生凝膠化現象［2］，高黏度底物對酶產生抑制及失活作用而引起酶活力下降，導致反應速率下降［9］。為解決傳統酶修飾方法時間長、成本高、得率低的問題。實驗以DH為指標，分別采用微波輻照、加熱處理、高速剪切對高濃度SPI進行酶修飾預處理，比較三種方法對酶修飾產物的影響，篩選出適宜的預處理方法及參數，使高濃度SPI在較短時間的酶修飾作用下提高DH，以增加其等電點處的溶解性。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

大豆分離蛋白 哈高科大豆食品有限責任公司，蛋白質87.11%、脂肪1.98%、水分5.84%、灰分4.95%；風味蛋白酶 丹麥NOVO公司，酶活力5.0×104U/g；果糖、水合茚三酮等 均為分析純。

BüCHI B-290型噴霧干燥機 瑞士 BüCHI Spray Dryer公司；HR-7103EI微波爐 青島海爾集團；JJ-2B高速組織搗碎機 江蘇省金壇市容華儀器制造有限公司；LD4-2A離心機 北京醫用離心機廠；H722可見分光光度計 天津市普瑞斯儀器有限公司；HYP-Ⅱ型消化爐與凱氏定氮儀 上海纖檢儀器有限公司；pHS-3C型酸度計 上海精密儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆分離蛋白組分含量的測定 蛋白質含量測定采用（GB/T 5511-2003）；水分含量測定采用（GB/T 5479-85）；脂肪含量測定采用（GB/T 5009.6 -2003）；灰分含量測定采用（GB/T 14770-1993）。1.2.2 蛋白酶活力的測定 福林酚法（QB/T 1803-1993）。

1.2.3 水解度（DH）的測定 采用茚三酮比色法［10］。

1.2.4 溶解性的測定 準確稱取100mg樣品，加入15mL蒸餾水，用0.1mol/L HCl調節pH4.5，室溫下磁力攪拌30min，離心（4000r/min，30min）。凱氏定氮法測定該pH條件下離心后上清液中蛋白質含量及總的蛋白含量［11］。

溶解性（%）=（離心后上清液中蛋白含量/總蛋白含量）×100%

1.2.5 蛋白質含量測定 采用凱氏定氮法（GB5009.5-2003）。

1.2.6 微波輻照預處理 在不同微波功率、輻照時間條件下，對10%（W/V）的SPI溶液進行預處理，其它酶修飾參數同1.2.9。考察微波功率、輻照時間對0.5～2.0h內酶修飾產物DH的影響。

1.2.7 加熱預處理 在不同加熱溫度、時間條件下，對10%（W/V）的SPI溶液進行預處理，其它酶修飾參數同1.2.9。考察加熱溫度、加熱時間對0.5～2.0h內酶修飾產物DH的影響。

1.2.8 高速剪切預處理 在不同轉數、時間條件下，對10%（W/V）的SPI溶液進行預處理，其它酶修飾參數同1.2.9。考察高速剪切轉數、時間對0.5～2.0h內酶修飾產物DH的影響。

1.2.9 酶修飾產物的制備 配制10%（W/V）的SPI溶液，置于酶反應器中，添加0.50%風味蛋白酶，維持反應pH 7.0、溫度50℃恒定，每隔0.5h取樣，于90℃、15min鈍化蛋白酶，測定DH。經噴霧干燥得到酶修飾SPI。

1.2.10 統計分析 DH及溶解性平行測定三次，采用SAS 8.1軟件進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 微波輻照輔助酶修飾的研究

2.1.1 微波輻照預處理功率對酶修飾的影響 有研究證實，微波輻照可加速蛋白水解進程［12］。由圖1可知，輻照功率對酶修飾有顯著影響，修飾產物的DH隨輻照功率增加明顯升高（空白對照的DH僅為1.29%）。在輻照功率為420W，水解時間為2.0h時，樣品的DH達最大值3.14%。

圖1 功率參數對SPI酶修飾的影響

樣品在微波作用下有一個加溫和水分擴散的過程。蛋白質和作為極性分子的水在高頻率、強電場強度的微波場中可被極化，隨微波場極性的迅速改變，蛋白質及水等極性分子的電性質發生變化，將微波能轉換成熱能，從而使自身溫度升高，引起蛋白質變性［13］。提高輻照功率能促使二硫鍵（S-S）斷裂成為巰基（-SH），防止蛋白分子間的聚集作用，但功率過高又會促進S-S的形成，同時過度變性導致蛋白分子之間的聚集作用增強，酶修飾不完全，DH降低。2.1.2 微波輻照預處理時間對酶修飾的影響 由圖2所示，在相同的水解時間條件下，DH隨輻照時間的延長而緩慢增加。在水解時間2.0h，輻照時間為2min時，樣品DH達最大值3.14%；隨后DH下降，輻照時間為5min時，DH僅為2.44%。

圖2 時間參數對SPI酶修飾的影響

在微波的作用下，蛋白質變性后暴露出更多的酶作用位點，從而加速酶解反應，但輻照時間過長，則會引起分子間頻繁碰撞而產生大量的摩擦熱，樣品因微波熱效應引起過度變性而凝聚，使蛋白酶無法與其作用位點結合［14］。

2.2 加熱輔助酶修飾的研究

2.2.1 加熱預處理溫度對酶修飾的影響 溫度對SPI酶修飾的影響如圖3所示，隨溫度的升高DH增大，當溫度為90℃時，樣品的DH達最大值3.12%。溫度達100℃時，DH又有所下降。

圖3 溫度參數對SPI酶修飾的影響

Shigeru Utsumi等［15］研究表明，SPI的 11S在70℃下開始解離，在90℃時完全解離，7S在75℃時開始解離，亞基的解離使得立體結構變得松馳。因此，經90℃處理后，SPI四級結構遭到破壞，原來處于分子內部的水解位點暴露出來，有利于酶與SPI結合；溫度繼續上升會使SPI結構破壞過度，解離出來的亞基將重新結合成新的四級結構，降低水解速率［16］。

2.2.2 加熱預處理時間對酶修飾的影響 由圖4所示，90℃水浴預處理15min，水解效果最好，DH可達3.70%。隨后，加熱時間延長，DH反而下降，加熱25min時，酶解物在2.0h時DH僅為2.02%。

圖4 時間參數對SPI酶修飾的影響

Lydia J Campbell等［17］研究表明，熱變性程度和-SH變化有內在關系，適度熱變性使SPI分子中的-SH完全暴露出來。然而加熱時間過長，使原來存在于可溶性蛋白的部分-SH隨不溶性蛋白增加而逐漸減少，在較高的蛋白濃度下，11S的堿性亞基（通過S-S）和7S的β亞基（通過次級鍵）進一步聚合，形成的不溶性聚合多肽不利于酶的修飾，從而導致DH降低［18］。

2.3 高速剪切輔助酶修飾的研究

2.3.1 高速剪切預處理轉數對酶修飾的影響 由圖5可知，高速剪切轉數的大小對DH有顯著的影響。隨轉數的增加，酶修飾產物的DH呈先上升后降低的趨勢。當轉數在6000r/min時，酶修飾產物的DH增加趨勢最明顯，水解2.0h時樣品的DH達最大值3.60%。

圖5 轉數參數對SPI酶修飾的影響

對樣品進行高速剪切處理，物料受到強烈剪切、高速撞擊、劇烈振蕩等動力作用，使蛋白質分子結構伸展，內部的極性基團和疏水基團暴露出來-SH使酶與SPI充分接觸，因此DH增加。同時高速剪切處理使蛋白質聚集體產生不可逆的裂解，SPI的粒徑變小，增加了反應接觸面，加快酶修飾速率。但剪切轉數過大，使剪切稀釋作用過強，導致蛋白質分子的表觀直徑減少，不利于酶修飾的進行。

2.3.2 高速剪切預處理時間對酶修飾的影響 由圖6所示，酶修飾產物的DH隨剪切時間的增長，呈先上升后降低的趨勢，當酶修飾時間在2.0h，剪切時間為4min時，DH達最大值4.12%；剪切時間達5min時，樣品DH降至3.02%。

圖6 時間參數對SPI酶修飾的影響

研究表明，高速剪切時間過長，使樣品在分流、撞擊、剪切等一系列作用下產生的機械能轉化為不可逆熱能，從而導致溫度升高，蛋白過度變性，形成不溶聚合體，不利于酶修飾的進行［19］。

2.4 預處理輔助酶修飾之間的比較

在本實驗條件下，采用三種方法輔助風味蛋白酶對SPI進行酶修飾，得出適宜的微波輻照功率與時間、加熱溫度與時間、高速剪切轉數與時間等酶修飾的預處理條件，研究了在這些適宜條件下酶修飾物DH的變化，將其與空白對照樣進行比較。

由圖7可知，通過三種處理輔助SPI酶修飾，在相同水解條件下，酶修飾時間0.5～2.0h內DH均有不同程度的提高，其中，高速剪切處理輔助酶解物DH提高最顯著。說明通過高速剪切輔助SPI進行酶修飾，在短時間內提高DH，并提高其溶解性，具有一定的可行性。高濃度SPI溶液在高速剪切過程中，劇烈的處理條件如液體高速撞擊、高剪切、空穴爆炸、高速振蕩等作用可能會導致大分子結構的改變［20］。

2.5 DH對溶解性的影響

溶解性與DH呈正相關［4］，本實驗對SPI在等電點（pH4.5）處溶解性和DH的關系進行了研究。

圖7 DH對照實驗

由圖8所示，經酶預處理修飾的SPI溶解性與空白對照相比有顯著提高。在低DH范圍內，溶解性隨DH的增加明顯上升。可能的原因在于：SPI經預處理后，蛋白質分子的表面電荷加強，使溶解性增強。SPI經風味蛋白酶作用后斷裂成小分子肽，使得-NH2和-COOH的數目增多，分子極性增加，分子間排斥作用增加，從而使溶解性增加［21］。當 DH為4.12%時，在等電點處，酶修飾SPI的溶解性可達到45.96%，提高了2.23倍。

圖8 DH對大豆分離蛋白溶解性的影響

2.6 預處理輔助酶修飾的結果比較

由表1可以看出，與空白對照相比，采用高速剪切處理輔助酶修飾，將改性時間由原來的4.5h減少到了2.0h，DH基本一致，且經高速剪切處理輔助酶修飾作用使SPI溶解性有提高。該預處理方式縮短了酶修飾時間，提高了反應效率。

表1 酶修飾結果的比較

3 結論

3.1 實驗表明：在相同酶修飾條件下，三種預處理方式均能提高酶修飾產物的水解度和溶解性，溶解性隨水解度的增加而增加。水解度分別提高了2.43倍、2.87倍和3.19倍，蛋白粉溶解性提高了1.65倍、1.76倍、2.23倍。

3.2 高速剪切預處理對大豆分離蛋白酶修飾水解度和溶解性增加尤為顯著，確定了高速剪切輔助酶修飾參數：剪切時間4min、轉數為6000r/min、SPI底物濃度10%，酶添加量0.50%。隨DH的增加，輔助酶修飾SPI粉在其等電點處的溶解性得到了顯著的改善，為擴大其應用范圍提供了條件。

3.3 高速剪切預處理可以加速酶修飾反應，縮短反應時間，提高效率。

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Effect of pretreatments on the degree of hydrolysis of hydrolyzed soy protein isolate

QI Lian-zi1，CHI Yu-jie2，*
（1.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Administration of Education Key Laboratory of Soybean Biology，Harbin 150030，China）

With the aim to determine the effect of microwave irradiation，heating and high-speed shearing on soy protein isolate，which have undergone protease hydrolysis.The degree of hydrolysis and solubility were evaluated to reveal the connection between them.Results showed that the solubility of soy protein isolate was improved with the degree of hydrolysis enhancement，which was increased by pretreatments.Hydrolysates were prepared at 50℃，depending on the concentration of flavourzyme at 0.5%and the protein concentration in solution at 10%.lt demonstrated that the degree of hydrolysis and solubility increased most significantly by high-speed-assisted hydrolysis.Degree of hydrolysis and solubility were increased by 2.43，2.87，3.19 and 1.65，1.76，2.23 times compared with the native protein respectively.Compared with the single hydrolysis reactions，the hydrolysis time by high-speed shearing-assisted technology was shortened from 4.5h to 2.0h.lt can be concluded that high-speed shearing can be used as an efficient method to improve the degree of hydrolysis and the DH and solubility of soy protein isolate.

soy protein isolate；degree of hydrolysis；microwave irradiation；heating treatment；high-speed shearing

TS201.2+1

A

1002-0306（2010）12-0156-04

2010-01-28 *通訊聯系人

齊蓮子（1983-），女，碩士，研究方向：食品化學。

教育部博士點基金（20070224001）；黑龍江省自然科學重點基金項目（ZD200902）。