普洱茶對原代小鼠肝細胞的毒性初探

李紅霞，孫永科，李艷艷，徐昆龍

（云南農業大學動物科技學院，云南昆明650201）

普洱茶對原代小鼠肝細胞的毒性初探

李紅霞，孫永科，李艷艷，徐昆龍*

（云南農業大學動物科技學院，云南昆明650201）

以小鼠原代肝細胞為模型，研究不同濃度普洱茶對小鼠原代肝細胞增殖率的影響、細胞凋亡及其細胞超微結構的變化，綜合評價普洱茶對肝細胞的毒性作用，建立普洱茶細胞水平的安全性評價方法。實驗結果表明：受試物普洱熟茶與普洱生茶IC50分別為6830、6459μg/mL，表明其對肝細胞毒性極小或無；細胞凋亡和電鏡超微結構觀察后顯示，當茶樣濃度在1/16 IC50～IC50濃度范圍時，未見誘導小鼠肝細胞發生凋亡；茶樣濃度達到IC50時，也未見對小鼠肝細胞內部結構發生有意義的病理損傷。因此，普洱生茶和熟茶對小鼠肝細胞的毒性極小或無，細胞毒理學研究表明飲用普洱茶是安全的。

普洱茶，原代小鼠肝細胞，細胞毒性

普洱茶是云南獨有的特產茶，特殊的原料、環境、工藝和貯藏條件賦予了普洱茶獨特的品質，深受廣大消費者的青睞［1-5］。鑒于普洱茶生產過程中存在一個微生物參與的特殊的渥堆發酵過程，增加了其成品生化成分和代謝產物的復雜性。近幾年，隨著普洱茶消費人群越來越多，掀起了全國普洱茶熱。在這種趨勢下消費者對純天然、高質量、高品質、無污染茶葉的需求也與日俱增。因此，人們也十分關注普洱茶飲用的安全性。迄今，國內外對普洱茶的研究尚屬起步，對其安全性評價的研究處于滯后狀態，尤其對其復合成分的毒理學安全性評價研究報道甚少。傳統動物毒理學研究耗資大、時間長，遠遠不能滿足對新的受試物進行及時毒理學檢測的需要，同時受國際動物保護主義的影響，現今趨向用細胞進行受試物的毒性檢驗［6-7］，但普洱茶的細胞毒性研究尚未見報道。本實驗以臨滄市具有代表性的普洱生茶和熟茶為樣本，小鼠原代肝細胞為模型，檢測不同濃度普洱茶對小鼠原代肝細胞增殖率的影響、細胞凋亡及細胞內部結構的變化，綜合評價普洱茶對肝細胞的作用機制，對普洱茶進行細胞水平的安全性評價，初步探討一種經濟、適用、快速的普洱茶細胞毒理學評價方法［8-9］。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

普洱熟茶與生茶 購自云南臨滄千年古茶有限責任公司，生產日期：2007年7月，產品標準號：DB53/103-2006，衛生許可證號：云衛食證字（2006）第530902-000013；健康昆明種小鼠 由昆明醫學院動物實驗中心提供，許可證號：SCXK（滇）2005-0008；新生牛血清（GIBCO）、胰島素、Hoechst33342、琥珀酸脫氫酶（MTT）、Hepes Sigma-Aldrich公司產品；M199培養基、膠原酶IV型、胰蛋白酶-EDTA消化液 Invitrogen公司產品。

RE-2000旋轉蒸發儀，SW-CJ-2FD型超凈工作臺，HH.CP-01W 型二氧化碳培養箱，IX51型OLYMPUS熒光倒置顯微鏡等。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶湯的制備

圖1 茶湯制備工藝流程

1.2.2 小鼠原代肝細胞的培養 取成年小鼠10只，雌雄各半，合籠交配，飼喂繁殖飼料。在孕鼠即將分娩前1～2d，取出引頸處死，于超凈工作臺內75%酒精中浸泡10s，剖腹取出胎鼠，將胎鼠中的肝組織放入無菌小燒杯，用D-Hank′s液洗2～3次，用眼科剪剪成1mm3大小的碎塊，PBS清洗3次，加入10倍體積的混合消化液，置37℃、體積百分比為5%的CO2培養箱中消化15min，加入含有10%小牛血清的M199終止消化，溫和振蕩后，將含有細胞的上清液經3層紗布過濾后移入離心管，2000r/min離心4min，棄上清，加入DHank′s液反復清洗3次，用M199培養液重懸后轉入細胞培養瓶，37℃、5%CO2濃度培養箱培養，每隔48h換液一次［10］。當細胞長滿瓶底85%左右，進行細胞傳代。棄去上清液，用PBS液清洗細胞2次、加入0.25%胰酶消化1～2min，待細胞開始收縮、變圓、折光度增強，細胞間出現空隙時，加入含10%小牛血清的完全培養基終止胰酶消化，吹打細胞約1～2次至細胞完全吹散后，分裝至2個細胞培養瓶，每2d換全液1次，依此方法傳代［11-12］。

1.2.3 細胞增值率的測定 將處于對數生長期的小鼠肝細胞按4000個/孔接種至96孔板，待細胞貼壁后把不同濃度受試物加入96孔板培養觀察24h，大致確定各受試物對細胞的最大致死濃度范圍。收集對數期小鼠肝細胞，調整細胞懸液濃度，每孔100μL接種至96孔板中央62孔內（邊緣32孔作調零孔），使待測細胞密度4000個/孔，放入CO2培養箱。待細胞貼壁后，吸出原培養基，第2和第11排加普通培養液做空白對照，第3至第10排每孔加100μL不同濃度受試物，每個濃度設6個復孔，放入CO2培養箱培養。加入受試物48h后每孔加入10μL MTT溶液（5mg/mL），繼續培養4h，終止培養，小心吸棄孔內培養液。每孔加入200μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解，在酶標儀490nm處測量各孔吸光度A值，每一濃度的A值均為6孔的平均值，將得到的A值按如下公式換算成細胞增殖率：

細胞增殖率（%）=（給藥組平均A值/對照組平均A值）×100%

IC50計算公式：

lgIC50=Xm-I［P-（3-Pm-Pn）/4］

細胞抑制率（%）=（1-給藥組平均A值/對照組平均A值）×100%

式中：Xm-lg最大劑量；I-lg（最大劑量/相臨劑量）；P-陽性反應率之和；Pm-最大陽性反應率；Pn-最小陽性反應率；公式中最大最小陽性反應率就是最大最小抑制率。

評定標準根據美國藥典中［13］所述的評定標準分別對細胞毒性分級、細胞毒性相對增殖率與細胞毒性的分級，見表1。

表1 細胞相對增殖率與細胞毒性的分級

1.2.4 細胞凋亡檢測 收集對數期小鼠肝細胞，計數，按每孔2×105接種于6孔板，放入37℃、CO2培養箱培養。參考相關研究的劑量選擇［14］，熟茶和生茶按濃度為IC50、1/4 IC50、1/16 IC503個劑量組的受試樣品分別加入6孔板，同時做陰性對照。染色作用24h后取出用PBS洗凈上層培養基、棄上清，加入Hoechst33342（終濃度10μg/mL），37℃避光孵育30min。將經過Hoechst 33342染色后的6孔板置熒光顯微鏡下，在波長為510nm下觀察細胞核熒光形態［10］。

1.2.5 電鏡觀察細胞超微結構 取對數生長期肝細胞，用含10%胎牛血清的M199培養基稀釋成1× 104/mL的細胞懸液，分別接種于7個培養瓶中，待細胞生長至60%～70%時，以熟茶和生茶終濃度為IC50劑量作用細胞24h（并設陰性對照），0.25%胰酶消化，磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗2次，高速離心形成細胞團，將細胞團塊懸浮于2.5%戊二醛固定液中送檢，然后將各組數據用SAS6.12軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 小鼠原代肝細胞的培養

剪碎的組織塊經消化液消化后，鏡下可見到大量單個細胞懸浮在培養瓶中，過濾離心，接種后6～12h即可部分貼壁，細胞呈圓形或橢圓形，胞漿透亮，細胞密度較小，尚未伸展。用臺盼藍拒染計數顯示，85%細胞排斥染色。20～48h后觀察，已有許多細胞貼壁，并開始伸展，細胞形狀不規則。大約5～7d后，細胞已匯合成單層鋪滿瓶底，多呈菱形與梭狀，見圖2所示。

培養的小鼠原代肝細胞在電鏡下可見細胞間毛細膽管，玫瑰花瓣樣糖原顆粒、車輪狀線粒體、大量粗、滑面內質網，符合肝細胞的形態結構。

2.2 不同濃度茶湯對小鼠肝細胞增殖率的影響

從表2可以看出，茶湯濃度在125～500μg/mL時，細胞相對增殖率與對照組差異不顯著，根據細胞毒性分級標準，屬1級毒性，為合格的反應物。茶湯濃度在1000和2000μg/mL時，與對照組差異顯著，但細胞的相對增殖率75%以上，也屬于反應合格的濃度范圍。高濃度的茶湯（4000～16000μg/mL）細胞增殖率與對照組差異極顯著。

表2 茶湯對小鼠肝細胞增殖率的影響

圖2 小鼠原代肝細胞（10×）

2.3 細胞IC50統計結果

根據歐盟國家實驗室藥物毒性判定標準（IC50≥1500μg/mL，細胞毒性極小或無）。本實驗測定的熟茶與生茶IC50分別為6830、6459μg/mL，兩者均大于1500μg/mL，說明普洱茶對小鼠肝細胞毒性極小或無，從細胞水平上，證實了普洱茶的飲用安全性。

表3 受試物對細胞的半抑制濃度IC50值（μg/mL）

2.4 細胞凋亡檢測結果

根據MTT測定結果，以熟茶與生茶終濃度為IC50、1/4 IC50、1/16 IC503個劑量組進行Hoechst33342染色法觀察細胞凋亡，同時設陰性對照，結果見圖3。

由圖3可以看出，不同濃度茶湯作用細胞后經Hoechst33342染色，細胞核呈彌散均勻的藍色熒光，染色質較均勻分布。沒有出現核固縮、核破碎塊狀或產生凋亡小體，與對照組沒有形態學上的差異，由此可以判定茶湯濃度在1/16 IC50～IC50劑量范圍內，未見誘導小鼠肝細胞發生凋亡。

2.5 透射電鏡觀察細胞超微結構

將熟茶與生茶IC50時的濃度作用于肝細胞，在透射電鏡下觀察細胞超微結構的變化，同時做陰性對照，結果見圖4所示。

陰性對照組（圖4A）肝細胞體積大小正常，細胞核染色質均勻分布，核膜完整，無變形，細胞質內有大量的線粒體、粗面內質網、游離核糖體，線粒體嵴較完整，粗面內質網無脫顆粒現象。

實驗組圖4B與圖4C，肝細胞體積正常，細胞核染色質較均勻分布，細胞質中各細胞器無明顯變化，線粒體和粗面內質網體積數量均正常。

圖3 Hoechst33342染色結果（40×）

圖4 透射電鏡觀察細胞超微結構變化

3 討論

肝臟是機體主要解毒器官之一，外源性化合物對肝細胞的毒性作用主要表現在組織細胞的凋亡和超微結構的改變。1972年Kerr提出“細胞凋亡主要形態表現在細胞核染色質的凝集”，這至今仍是檢測凋亡細胞的形態指標。在細胞內部結構中，線粒體是提供各種細胞活動所需要的化學能量，是產生細胞內主要能量來源的細胞器，當它的損傷超過一定限度，細胞就會衰老死亡。此外，粗面內質網是細胞中合成蛋白質的主要場所，粗面內質網的表面附著大量核糖體顆粒，因此，粗面內質網數量及形態的改變標志著細胞衰老、損傷，甚至惡化的程度。細胞凋亡研究表明，普洱生茶和普洱熟茶茶樣濃度在1/16 IC50～IC50之間時，不會誘導小鼠肝細胞發生凋亡。電鏡結果顯示實驗組的肝細胞體積正常，細胞核和細胞器保存良好，接近正常對照組肝細胞的形態。可見，普洱生茶和普洱熟茶茶樣的IC50濃度不會損傷小鼠肝細胞的內部結構變化。從細胞凋亡檢測與電鏡超微結構變化結果證實，普洱生茶和普洱熟茶茶樣對小鼠的肝細胞沒有實質性毒性作用。

實驗結果表明，普洱熟茶與生茶對小鼠肝細胞半抑制濃度（IC50）分別為6830、6459μg/mL，對細胞毒性極小或無。茶樣濃度在1/16 IC50～IC50濃度范圍內，不誘導小鼠肝細胞發生凋亡。茶樣濃度為IC50時，也不會對小鼠肝細胞內部結構發生有意義的病理損傷，因此，本實驗從細胞水平上證實了普洱茶飲用的安全性。

［1］中華人民共和國國家標準GB/T 22111—2008［S］.地理標志產品普洱茶.

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Preliminary study on Pu’er tea influencing mouse primary hepatocyte in cytotoxicity

LI Hong-xia，SUN Yong-ke，LI Yan-yan，XU Kun-long*
（Faculty of Animal Science，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China）

ln this study，the mice primary hepatocyte culture was used to study the cytotoxicity，cells apoptosis，and cell ultrastructure was observed by transmission electron microscopic.Cytotoxicity by the Pu′er tea was synthetically evaluated，safety assessment methods on cell level of the Pu′er tea was established.The results showed that lC50of Pu′er mature tea and raw tea was 6830，6459μg/mL separately.The test substance cytotoxicity was small or not.lC50of tea polyphenol monomer and caffeine monomer results showed that they were the main factors of inhibit cell proliferation.According to observation of cells apoptosis and cell ultrastructure，between 1/16 lC50tea concentration and lC50of tea concentration，exerted no induce mice hepatocyte apoptosis.When tea concentration was up to lC50，no meaningful of pathological injury was exerted.The cytotoxicity of two samples was very small or not.Cells toxicity test completely applied to safety evaluation of Pu’er tea.

Pu’er tea；mouse primary hepatocyte；cytotoxicity

TS201.4

A

1002-0306（2010）12-0322-04

2010-06-17 *通訊聯系人

李紅霞（1982-），女，碩士研究生，主要從事食品質量與安全方面的研究。

國家科技支撐計劃項目（2007BAD58B05）。