酵母液泡蛋白酶的研究進展

劉曉杰，章海鋒，傅明亮，劉 婧，陳啟和，何國慶

（浙江大學食品科學與營養系，浙江杭州310029）

酵母液泡蛋白酶的研究進展

劉曉杰，章海鋒，傅明亮，劉 婧，陳啟和*，何國慶

（浙江大學食品科學與營養系，浙江杭州310029）

在啤酒酵母中，液泡發揮了重要的生理作用，包括pH調節和代謝控制、蛋白質降解、氨基酸以及無機離子的儲存。這一系列的功能均依賴于液泡中一些特定的蛋白酶。酵母細胞內大多數酶的成熟均依賴于這些蛋白酶的加工修飾作用。近年來國外研究人員對蛋白酶的這種加工修飾作用進行了深入研究，但在國內尚不多見。本文依據國內外研究進展對啤酒酵母液泡中常見的幾種蛋白酶生物特點及其生理功能進行了綜述，以便更好地認識酵母蛋白酶，為進一步研究打下理論基礎。

啤酒酵母，液泡蛋白酶，生物性質

在啤酒工業中，蛋白含量一直是企業及相關研究人員關注的重點。一定的蛋白質含量有助于啤酒的起泡性和穩定性，然而過多的蛋白質含量又對啤酒品質不利，比如啤酒的冷渾濁等非生物穩定性問題。啤酒釀造過程中的蛋白酶主要有三個來源。第一個來源是麥芽，在大麥發芽時會產生自然蛋白酶，它經過麥汁煮沸后被除去，不會有所殘留。第二個來源便是認為添加的蛋白酶，如木瓜蛋白酶就是啤酒中應用最廣的蛋白水解酶，這主要是用于控制啤酒中的高分子量蛋白質，提高啤酒的非生物穩定性。第三個來源是來自酵母，也是啤酒中蛋白酶的最主要來源，對啤酒質量起重要作用［1］。因此，從菌種的角度出發，探討酵母蛋白酶種類及其作用，進而通過基因工程手段敲除或通過轉化轉導等方式使酵母獲得某些蛋白酶基因成了該領域許多研究人員的重點研究對象。早在20世紀之前人們就已在酵母中發現了蛋白酶，在20世紀20年代才開始對酶特性進行研究。在20世紀70年代，發現8種酵母蛋白酶：蛋白酶A和B，羧肽酶Y和S，3種氨基態酶和一個單一的二肽酶。在80年代中期，由于生色底物技術的發展，已知的酵母蛋白酶數量已經增加到約40種［2］。其中研究比較多的有四種，它們分別是蛋白酶A、蛋白酶B、羧肽酶和氨肽酶。本文將就啤酒酵母這四種蛋白酶酶學特性及其可能對啤酒品質帶來的影響加以探討，以期對其有更加清晰的認識。

1 酵母蛋白酶A的酶學性質及其生物學功能

酵母蛋白酶A（proteinase A，簡稱PrA）是一種酸性蛋白酶，其特性與哺乳動物豬胃蛋白酶、組織蛋白酶D和E以及人的血管緊張肽原酶相似，由于這些酶氨基酸數目大約為327，并且序列同源性都大于40%，活性中心保守序列Asp33-Thr-Gly-Ser及Asp218-Thr-Gly-Ser中天冬氨酸側鏈參與了催化作用，因此這幾種酶都叫天冬氨酸蛋白酶［4］。酵母蛋白酶A［EC3.4.23.25］是一種酸性蛋白酶，位于啤酒酵母液泡中，該酶由位于酵母染色體XVI的GAL4近端的PEP4（也叫 pHO9或 PRA1）基因（2146bp）編碼，PEP4基因通過轉錄形成1800bp的mRNA，然后翻譯形成405個氨基酸殘基組成的蛋白酶A前體，即前蛋白酶A原（preproproteinase A，簡稱preproPrA），前蛋白酶A原是由405個氨基酸殘基組成的單體蛋白，包括氨基端信號肽、前肽、活性蛋白酶A三部分，分子質量約44ku［5］。前蛋白酶A原在內質網中進行糖基化修飾，其N端由22個氨基酸殘基組成的信號肽也在內質網中被切除。在高爾基復合體中糖鏈被剪切并延伸進而形成分子量約52kDa的蛋白酶A原。蛋白酶A原經核內體最后轉運到液泡，酶原在液泡中進行自動激活，由54個氨基酸殘基組成的前肽通過蛋白酶A原Glu-76和Gly-77間的肽鍵斷裂被切除［6］。酵母蛋白酶A由一條多肽鏈組成，有兩個拓撲學相似的葉片狀結構域，無四級結構。

酵母蛋白酶A能催化細胞內蛋白質水解，特別是在N缺乏、孢子形成時，蛋白酶A通過水解蛋白質為孢子新蛋白合成提供氨基酸來源。在液泡中，酵母蛋白酶A參與多種酶的轉錄加工和成熟過程，如蛋白酶B前體及其酶原被蛋白酶A切割后進一步對羧肽酶Y前體進行加工，蛋白酶A也可以直接切割羧肽酶Y前體并使其成熟。另外，氨肽酶I、核糖核酸酶、堿性磷酸酶、海藻糖酶的成熟激活都與蛋白酶A有關［7］。

在正常代謝途徑下，蛋白酶A原應按指定路徑從高爾基體運輸到液泡中，而酵母在逆境條件下，如發酵后期以及高壓條件下，蛋白酶A原就會從酵母活細胞內輸到胞外［8］。此外發酵后期的營養饑餓導致酵母自溶也是啤酒中蛋白酶A的重要來源。

圖1 酵母細胞分泌蛋白酶A到胞外和降解泡沫活性蛋白的模式

酵母蛋白酶A底物特異性小，最適作用條件為酸性。酵母活力越高，蛋白酶A分泌量越少；隨著酵母活力的降低，蛋白酶A分泌量增多，活力提高，發酵終了達最大值。低氮條件下的分泌量要比氮源充足時要多。啤酒發酵過程中pH越高，蛋白酶A分泌量低；發酵結束時酵母胞液pH降低，蛋白酶A分泌量增多。后酵過程儲存時間越長、溫度越高，蛋白酶A分泌量越多。

王肇悅等對啤酒以及啤酒泡沫陽性蛋白進行了電泳分離并加以比較，結果發現，啤酒泡沫40和10kD兩種蛋白的相對含量較高，這兩種蛋白的分子量與蛋白質Z和脂肪轉運蛋白（LTP）一致，而蛋白質Z與LTP正是現在公認的兩種泡沫陽性蛋白。進一步將啤酒原液用鹽酸調pH到2.0及3.0，加酵母蛋白酶A粗提液分別作用24、48、72h后進行電泳分析，而對照樣品粗酶液在70℃水浴中保溫30min。結果顯示，啤酒蛋白在pH2和pH3條件下被酵母蛋白酶A作用24h后的結果相似，均為分子量為10kDa的蛋白（LTP1）條帶消失。說明蛋白酶A對啤酒中的該蛋白酶有水解作用。而該蛋白恰恰是兩種重要的啤酒泡沫陽性蛋白之一［5］。

2 酵母蛋白酶B的酶學性質及其生物學功能

酵母蛋白酶B（proteinase B，簡稱PrB）是酵母液泡中的蛋白質水解酶，屬內切酶類。同植物細胞中的該蛋白酶一樣，它參與氮缺乏條件下細胞內蛋白質的降解，以提供孢子形成以及子囊成熟所需的氮源。蛋白酶B是一種糖蛋白，分子量33000，包含一個糖基側鏈，分子量3000、39000為蛋白質。其表達需要蛋白酶A激活蛋白酶B酶原，在蛋白酶A缺乏的條件下，分子量為42000的蛋白酶B酶原便積累下來。在細胞正常生長條件下，蛋白酶B活性很低，當碳源耗盡，酵母開始利用乙醇為碳源時酶活迅速提高。在生長受阻條件下酶活至少為細胞正常生長條件下的300倍［12］。Charles等通過對蛋白酶B基因進行研究發現，相關信使RNA由分子量為2.2kb的基因編碼，該段基因可以編碼分子量約為69000——大約是蛋白酶B分子量的2倍、含633個氨基酸、約含300個不可譯5′和3′核苷酸。為了探究PRB1基因除了編碼蛋白酶B以外是否編碼其他功能性成分，實驗者敲除了酵母PRB1基因上介于最左邊至中間位置的ECORI之間的1.6kb的基因序列。得到了PRB-的酵母菌株。通過對菌落的比較發現工程菌與野生菌落之間沒有顯著差別，也因此證明PRB1基因為一個能自我復制的基因片段。結構上與枯草桿菌蛋白酶家族中的絲氨酸蛋白酶相近［14］。

3 酵母羧肽酶B的酶學性質及其生物學功能

羧肽酶B（carboxypeptidase B，CPB）是一類水解蛋白或多肽底物C端Lys或Arg的金屬蛋白酶。也稱為蛋白酶C。動物體內羧肽酶B由胰腺細胞分泌，起初以含信號肽及前肽的前羧肽酶原B（preprocarboxypeptidase B）形式存在，在轉運至內質網的過程中被信號肽酶切除掉信號肽而形成無活性的羧肽酶原B（procarboxypeptidase B，proCPB），羧肽酶原B在小腸經胰蛋白酶特異水解剪切前肽后而被活化。成熟的鼠羧肽酶B含307個氨基酸，其前體中的信號肽和前肽分別由13個氨基酸及95個氨基酸組成。每摩爾羧肽酶B中含一個鋅原子，它是羧肽酶B發揮功能活性所必須的［10］。它特異的水解肽鏈C端的堿性氨基酸：精氨酸、賴氨酸或鳥氨酸。由于一種新型的腫瘤靶向化療方法——抗體導向酶-前體藥物療法（antibody—directed enzyme prodrug therapy，ADEPT）的興起而受到相關研究人員的關注。它以抗體為靶向載體，將前體藥物的專一性活化酶定位在病變部位，前體藥物在病變部位局部被激活為細胞毒性藥物，發揮治療作用，增強了化療藥物的組織特異性，減少了其對正常組織的毒副作用［11］。Akio等在篩選分泌CPY的酵母菌株的基因屏幕中發現，要尋找CPY從高爾基體向液泡分泌的正確靶點至少要鑒定50Vps的分選基因。Vps38p和Vps34p是其中重要的兩種，均為 3-磷脂酰肌醇激酶［13］。

4 酵母氨肽酶的酶學性質及其生物學功能

氨肽酶（aminopeptidase，Ape1）是在營養饑餓條件下細胞生長和自噬階段通過細胞質-液泡（cytosol -to-vacuole targeting，Cvt）定向途徑運輸到酵母液泡中的一種cargo蛋白。然后在液泡中被加工為成熟的氨肽酶。已被純化結晶的Ape1有兩種結構，第一種空間結構屬p2（1）型，晶胞參數：a=120.6，b= 219.5，c=133.1A，beta=116.5；第二種類型屬R3空間結構群，晶胞參數：a=141.2，c=349.4A。自旋功能和體積與質量的比值表明，類型一和類型二的每個不對稱單位中分別含有12和4個前氨肽酶原（mApe1）分子，而前酶原mApe1在兩種晶形的四面體中均有存在［15］。氨肽酶屬于肽鏈端解酶，可使氨基酸從多肽鏈的N-末端順序逐個地游離出來。在許多生物中發現了各種性質的這種酶。具有代表性的是亮氨酸氨肽酶，特殊的有僅作用于N末端為脯氨酸的脯氨酸亞氨肽酶以及只作用于三肽的氨基三肽酶等。氨肽酶在液泡相關水解蛋白定位機制中的研究比較多。API沒有標準的信號序列，含有氨基末端多肽鏈，Daniel等對該酶的生物合成今年進行了研究，以探究API向液泡的轉運機制。研究發現，API同其他液泡蛋白酶一樣起初以無活性的酶原形式存在，其成熟依靠蛋白酶A的修飾作用，API從前體至成熟大概要90min，經過這一加工過程后，API前體仍然留在細胞質中，并不進入分泌途徑，前體不經過糖基修飾。其前肽以sec-independent方式脫除。在VPS突變體或過度表達菌株中，成熟的API及前體均不分泌到細胞外。經分泌途徑的液泡水解蛋白呈現以下兩個特點：一是API基因至成熟的氨肽酶轉化時間延長；二是前體的大量積累。這些結果表明，API是在經過翻譯后的加工過程后進入液泡的，這不同于其他液泡水解蛋白酶［16］。氨肽酶在生物機體內廣泛存在，同白細胞3烯水解酶A4一樣，氨肽酶在生物體內起著降解或加工無生物活性多肽的作用［17］。

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Research progress in Saccharomyces cerevisiae vacuolar proteinase

LIU Xiao-jie，ZHANG Hai-feng，FU Ming-liang，LIU Jing，CHEN Qi-he*，HE Guo-qing
（Department of Food Science and Nutrition，Zhejiang University，Hangzhou 310029，China）

ln the yeast Saccharomyces cerevisiae，the vacuole is integrally involved in a wide array of physiological processes.These include pH and osmoregulation，protein degradation and storage of amino acids，small ions，and polyphosphate.These diverse functions necessitate the presence in the vacuole of a specific group of proteinase. The maturity of most vacuole enzyme was dependent on the processing and modification of these proteases.ln recent years，the kinds of processing and modification had been studied deeply in many foreign labs，but little had been carried out in domestic research institutions.This paper summarized the biological characteristics and their physiological functions of several common proteinase in the vacuole of Saccharomyces ceversiae based on many current research achievements both domestic and abroad.So as to get a better understand of beer yeast proteinase as well as lay a foundation for further study.

Saccharomyces cerevisiae；vacuolar proteinase；biological property

TS261.1+1

A

1002-0306（2010）12-0377-03

2009-12-03 *通訊聯系人

劉曉杰（1986-），女，碩士研究生，研究方向：生物代謝工程。

國家高技術研究發展計劃（863計劃）（2007AA10Z315）。