水酶法提取石榴籽油工藝研究

苗利利，夏徳水，高麗娜，仇農學

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安710062）

水酶法提取石榴籽油工藝研究

苗利利，夏徳水，高麗娜，仇農學*

（陜西師范大學食品工程與營養科學學院，陜西西安710062）

以石榴籽為原料，利用水酶法提取石榴籽油。通過單因素及二次回歸旋轉組合實驗研究了料液比、石榴籽粒度、酶的種類、酶解溫度、提取時間、離心時間、pH以及酶的添加量等因素對出油率的影響，確定了水酶法提取石榴籽油的最佳工藝條件。結果表明，酶解最佳工藝參數為：用Alcalase蛋白酶添加量為1.0%（mL/g），原料粒度40目，料液比1∶5（g/mL），提取溫度50℃，提取時間6h，pH8.0，離心時間25min，在該工藝條件下石榴籽油出油率達18.2%。

水酶法，石榴籽油，提取

石 榴（Punica granatum L.）為 石 榴 科（Punicaceae）石榴屬（Punica L.）落葉灌木或小喬木，我國南北各地均有種植。石榴果除了可直接食用以外，還可以加工成飲料、酒、醋等。加工剩余之石榴皮富含鞣質（平均含量22%）可用作制革工業和棉毛染織業的原料，而大量石榴籽卻被廢棄，造成資源浪費和環境污染。Maya Kaufman等人［1］報道，石榴籽油中石榴酸的含量64%～83%，具有防治高血脂癥、心腦血管疾病、抗腫瘤等效應而廣受重視。國外近年的研究表明［2-3］，石榴籽油及提取物具有較好的抗氧化、防治乳腺癌、降血糖、抗腹瀉等作用，石榴酸及其共軛三烯異構體證明對鼠腫瘤細胞和人單核白血病細胞有強的細胞毒活性［4-6］，石榴籽油是對健康很有益的一種可食用油脂。李文敏等人［7］對石榴籽油進行了微波輔助提取工藝優化的研究。馬齊等人［8］對常規回流提取石榴籽油進行了研究，并對油脂進行了成分分析，其主要成分含量如下：棕櫚酸2.5%，硬脂酸 1.6%，油酸 4.7%，石榴酸 62.9%，桐酸21.6%。水酶法是近年來廣泛研究的一種油脂提取新工藝，與傳統工藝相比具有諸多優點［5］。由于其條件溫和，所需能量少，提取的油具有較好的品質，且有利于物料的進一步綜合利用而受到國內外很多學者的重視［9-10］。本文就水酶法提取石榴籽油工藝條件進行研究，以期為石榴籽油的工業化生產提供參考依據，并為石榴的綜合開發和精深加工提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

石榴籽 取自陜西恒興果汁飲料有限公司，產地為陜西臨潼，洗凈后低溫烘干備用。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市英峪予華儀器廠；KDF-2311型多功能食品粉碎機天津市康達電器公司；TDL-4型離心機 上海安亭科學儀器廠；B-324型凱氏定氮儀 瑞士BUCHI；SX2-11-13型馬弗爐 上海躍進醫療器械廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 石榴籽的處理 將石榴籽挑選、去除雜物，粉碎后過篩備用。

1.2.2 石榴籽成分的測定 水分的測定——參照GB5497-1985；粗脂肪的測定——參照GB/T5512-1985；粗蛋白的測定——參照GB/T5511-1985；灰分測定——參照GB/T8306-2002；纖維素測定——參照GB/T5009.10-1985。

1.2.3 石榴籽油提取工藝流程 石榴籽→清理粉碎→過篩→滅酶→調節固液比（pH）→添加酶→酶處理→滅酶→離心分離→石榴籽油

1.2.4 操作要點［11-12］準確稱取100.0g粉碎的石榴籽粉，裝入燒杯中，在一定pH緩沖液，100℃滅酶5min，降溫至50℃，然后加入酶在一定溫度下進行酶解，酶解后在一定轉速下離心一定時間，分離清油，得到的石榴籽油在105℃下干燥至恒重后，稱重計算出油率。1.2.5 石榴籽出油率的計算 計算公式如下：

其中：Y-出油率；W1-提取石榴籽油質量，g；W2-石榴籽粉質量，g。

1.2.6 實驗設計

1.2.6.1 單因素實驗 酶的種類：果膠酶、纖維素酶、Neutrase蛋白酶、Protamex蛋白酶、Flavourzyme風味蛋白酶等（酶用量為2%），料液比為1∶5（g/mL），酶解5h，pH和溫度均為所用酶的最適條件。

料液比：選用Alcalase蛋白酶，pH為8.0，酶解溫度為55℃，酶添加量為2%，分別以料液比為1∶3、1∶5、1∶7、1∶9（g/mL），確定最佳料液比。

原料粒度：其他條件同上，料液比為 1∶5（g/mL），分別以粒度為20、40、60、80目的原料進行酶解，確定最佳原料粒度。

提取溫度：其他條件同上，原料粒度為40目，分別以酶解溫度30、40、50、60、70℃，確定最佳提取溫度。

提取時間：其他條件同上，酶解溫度為50℃，分別以酶解時間3、4、5、6、7h，確定最佳酶解時間。

離心時間：其他條件同上，酶解時間5h，分別以離心時間20、25、30、35、40min，確定最佳離心時間。

酶的添加量：其他條件同上，離心時間30min，分別添加Alcalase蛋白酶0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，確定最佳添加量。

pH：其他條件同上，Alcalase蛋白酶添加1.0%，分別調節pH為7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，確定酶解最佳pH。

1.2.6.2 二次回歸旋轉組合優化實驗 在單因素實驗的基礎上，選用提取時間、料液比、提取溫度、酶添加量為實驗因素，以出油率為實驗指標，采用L36（45）二次回歸旋轉組合實驗，實驗因素和水平見表1。統計分析軟件：DPS v3.0專業版。

表1 L36（45）二次正交旋轉組合實驗因素水平表

2 結果與分析

2.1 石榴籽組成分析 采用粉碎過40目篩后的石榴籽為原料進行成分測定，結果如表2所示。

表2 石榴籽組成

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 不同酶對出油率的影響 以過40目粒度的石榴籽為原料，分別選用果膠酶、纖維素酶、Neutrase蛋白酶、Protamex蛋白酶、Flavourzyme風味蛋白酶等，酶用量為2%，料液比為1∶5（g/mL），酶解時間為5h，pH和溫度均為所用酶的最佳值；酶解完成后于100℃水浴滅酶 10min，冷卻后于 3500r/min離心20min，取上層液再離心10min后即得清油，計算出油率，結果如圖1所示。

圖1 酶的種類與出油率的關系

由圖1可知，果膠酶、纖維素酶效果不佳，這是由于這兩種酶的最適pH均為酸性，而石榴籽蛋白在酸性條件下比較穩定，雖然纖維素及果膠被酶解，但是蛋白質與油脂結合使得脂肪難以釋放。幾種蛋白酶的提取效果都較好，其中以Alcalase蛋白酶的提取效果最好，這可能是因為這種酶對石榴籽蛋白的酶解效果最好，使得石榴籽油能得到更好的釋放。

2.2.2 料液比對出油率的影響 選用Alcalase蛋白酶，pH為8.0，酶解溫度為55℃，酶添加量為2%，酶解5h，不同料液比對出油率的影響，如圖2所示。

圖2 料液比與出油率的關系

從圖2可以看出，在料液比1∶3～1∶5（g/mL）范圍內，隨著料液比的增加，出油率明顯增加，這說明水酶法提油時適量的水對提油是有利的。但是當底物濃度繼續降低，酶與底物的接觸減少，這樣酶的作用效果就會降低，從而導致出油率下降。因此，最佳料液比為1∶5（g/mL）。

2.2.3 原料粒度對石榴籽油出油率的影響 選用Alcalase蛋白酶，pH為8.0，酶解溫度為55℃，酶添加量為2%，料液比1∶5（g/mL），酶解5h，研究粉碎度對出油率的影響如圖3所示。

圖3 粉碎度與出油率的關系

由圖3可知，在20～40目的范圍內，隨著目數的增加，出油率明顯增大，這是因為物料變細，酶與原料都能更好地接觸，利于油脂的提取。而當粉碎度大于40目時，石榴籽粉碎過細，石榴籽油提取率反而下降，這是由于物料粒度對提取率有雙重影響，物料太細，易被壓實而降低酶的作用效果，不利于提取。因此，物料粒度選擇40目為好。

2.2.4 酶解溫度對出油率的影響 選用Alcalase蛋白酶，pH為8.0，粉碎度為40目，酶添加量為2%，料液比1∶5（g/mL），酶解5h，研究酶解溫度對出油率的影響如圖4所示。

圖4 酶解溫度與出油率的關系

從圖4可知，在30～50℃的范圍內，隨著溫度的升高，出油率增加，這是由于溫度升高越來越接近Alcalase蛋白酶的最適溫度，酶活性不斷增強。但是溫度高于50℃以后，出油率明顯降低，這是由于酶活性逐漸降低，酶解效果降低。因此，最佳酶解溫度為50℃。

2.2.5 酶解時間對出油率的影響 選用Alcalase蛋白酶，pH為8.0，粉碎度為40目，酶添加量為2%，料液比1∶5（g/mL），酶解溫度55℃，研究酶解時間對出油率的影響，如圖5所示。

由圖5可知，3～5h內隨著酶解時間的延長，石榴籽油出油率明顯升高，但是5h以后沒有明顯的變化。這是因為5h時酶解已經比較徹底，因此選擇5h為最佳酶解時間。

圖5 酶解時間與出油率的關系

2.2.6 離心時間對出油率的影響 選用Alcalase蛋白酶，pH為8.0，粉碎度為40目，酶添加量為2%，料液比1∶5（g/mL），55℃酶解5h，研究離心時間對出油率的影響，如圖6所示。

圖6 離心時間與出油率的關系

由圖6可知，小于30min時，隨著離心時間延長，石榴籽油出油率升高，油的分離效果呈上升趨勢，高于30min后沒有明顯變化，因此綜合考慮，30min為最佳離心時間。

2.2.7 Alcalase蛋白酶添加量對出油率的影響 選用Alcalase蛋白酶，pH為8.0，粉碎度為40目，料液比1∶5（g/mL），55℃酶解5h，研究酶的添加量對出油率的影響，如圖7所示。

圖7 酶添加量與出油率的關系

由圖7可知，Alcalase蛋白酶添加量在0.5%～1.0%范圍內時，石榴籽油出油率明顯增加，大于1.0%以后，出油率沒有顯著變化，綜合考慮酶解效果和經濟因素，酶添加量確定為1.0%。

2.2.8 pH對出油率的影響 選用Alcalase蛋白酶，粉碎度為40目，酶添加量為2%，料液比1∶5（g/ mL），55℃酶解5h，研究pH對出油率的影響，如圖8所示。

圖8 pH與出油率的關系

如圖8所示，pH對出油率影響較大，Alcalase蛋白酶為堿性酶，最適pH為8.0，從圖中我們就可以看到，當pH為8.0時出油率最高，高于或者低于該值出油率都呈下降趨勢，因此，酶解最佳pH確定為8.0。

2.3 二次回歸旋轉組合實驗優化工藝條件

在以上單因素實驗的基礎上，選用四因素五水平二次回歸旋轉組合進行石榴籽油提取工藝條件優化實驗，實驗結果見表3。

表3 L36（45）二次正交旋轉組合實驗結果

回歸方程失擬檢驗和顯著性檢驗：

由表4可知，FLf=F1=2.16903＜F0.1（10，11）= 2.25，表示失擬差異不顯著，即回歸方程對所有的實驗點擬合的較好，不存在其他對結果產生影響的未知因素；而F=F2=7.48987＞F0.01（14，21）=3.03，說明回歸時極顯著的，即實驗所選擇的四個因素對石榴籽油的出油率有顯著的影響。由此可以看出上面的二次回歸方程模型是合適的。

方差分析表最后一列表示各回歸系數的顯著水平p，從中可以看出，X2、X3、、X1X2和對石榴籽油出油率的影響程度在a=0.01水平達到極顯著，X4和在a=0.05水平達到顯著，X1和X2X3在a=0.1水平達到顯著。各因素對石榴籽油的出油率影響大小順序為：料液比＞酶解溫度＞酶添加量＞酶解時間。得到回歸方程：

通過DPS軟件的分析結果，得到了在本實驗各因素水平范圍內石榴籽油的最佳酶解提取技術參數為：酶解時間5h，料液比1∶5（g/mL），酶解溫度50℃，酶添加量1.0%。對該優化條件進行實驗驗證，在該最優條件下，平行實驗5次取平均值，得到出油率平均值為18.2%，而回歸方程的理論計算出的出油率值為18.5%，相差0.3%，小于5%，表明實驗優化得到的技術參數是可靠的。

表4 回歸方程方差分析表

3 結論

3.1 在水酶法提取石榴籽油的實驗中，反應酶解時間、料液比、酶解溫度、Alcalase蛋白酶用量以及時間對油的提取率都有一定的影響，且影響酶解反應的主次因素為：料液比＞酶解溫度＞酶添加量＞酶解時間。

3.2 根據實驗結果，確定最佳工藝條件為：酶解時間5h，料液比1∶5（g/mL），酶解溫度50℃，酶添加量1.0%，在此工藝條件下，石榴籽油的提取率達到18.2%。

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Study on extraction process of pomegranate seed oil by aqueous enzymatic method

MIAO Li-li，XIA De-shui，GAO Li-na，QIU Nong-xue*
（College of Food Engineering and Nutrition Science，Shaanxi Normal University，Xi’an 710062，China）

With pomegranate seeds as raw materials，the aqueous enzymatic method was used to extract its seed oil.The effects of solid/liquid ratio，particle size of material，type of enzyme，enzymatic hydrolysis temperature and time，pH and dosage of enzyme added were discussed by means of single experiments and quadratic regression rotation experiments.The optimum technical conditions were obtained as follows：dosage of Alcalase 1.0%（mL/g），particle size of material 40 screen mesh，solid/liquid ratio 1∶5g/mL，temperature of enzymatic hydrolysis 50℃，time 6h，pH 8.0，centrifugation time 25min，oil yield ratio could reach 18.2%.

aqueous enzymatic method；pomegranate seed oil；extraction

TS225.1+9

B

1002-0306（2010）12-0265-05

2009-12-18 *通訊聯系人

苗利利（1985-），女，碩士研究生，研究方向：食品分離技術。

國家大學生創新性實驗計劃項目（091071839）。