黑曲霉產殼聚糖發酵工藝的優化

李一婧，王廷璞，馬偉超，張文科

（天水師范學院生命科學與化學學院，甘肅天水741001）

黑曲霉產殼聚糖發酵工藝的優化

李一婧，王廷璞，馬偉超，張文科

（天水師范學院生命科學與化學學院，甘肅天水741001）

通過單因素及正交實驗對黑曲霉產殼聚糖的發酵工藝進行了優化。結果表明，最佳發酵條件為：70mL玉米漿，4%葡萄糖，1.2%硫酸鎂，8.0×108孢子量，pH7.4～7.6，轉速為130r/min，29℃發酵72h的殼聚糖的產率最高，達到18%。

黑曲霉，殼聚糖，優化

殼聚糖（chitosan）為甲殼素的脫乙酰化產物，是一種天然的生物高分子線形多糖，它是迄今為止唯一發現的陽離子動物纖維和唯一的堿性多糖［1］。在自然界中，甲殼素廣泛存在于低等植物菌類、藻類的細胞，節肢動物蝦、蟹、蠅蛆和昆蟲的外殼，貝類、軟體動物（如魷魚、烏賊）的外殼和軟骨，高等植物的細胞壁等，每年生物合成的資源量高達100億t，是地球上僅次于植物纖維的第二大生物資源，其中海洋生物的生成量在10億t以上，可以說是一種用之不竭的生物資源。如果將甲殼素中的乙酰基脫除，則得到溶解性大大改善的殼聚糖［2］。殼聚糖在提高機體免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗自由基、強化肝功能、降血糖、降血壓、降低血脂調節膽固醇方面具有明顯的作用［1］。另外，殼聚糖可作為固定化載體，其具有機械性能良好、化學性質穩定、耐熱性強、細胞毒性極低、親和性好、安全性高等優點。此外，其在醫藥、食品、農業、飼料添加劑、紡織方面、造紙工業、化妝品工業和環保等領域也有廣泛應用［2-6］。殼聚糖的制取通常采用化學法［5］，然而化學法生產殼聚糖耗能大、污染嚴重，并且生產的殼聚糖相對分子質量及脫乙酰度不均一，殼聚糖的脫乙酰度和乙酰基的分布對其物理化學性質和生物活性均有較大的影響［7］。此外，由于原料蝦殼或蟹殼不易收集且原料的質量不能保證穩定，時間長了還有腐敗的可能。因此從20世紀80年代起日本和美國先后開始研究用微生物發酵的方法生產殼聚糖，國內從20世紀90年代初也開始了這方面的研究，目前研究重點主要集中在菌株的選育和培養基的優化［8-9］。此外，能脫除甲殼質分子中的乙酰基，生成殼聚糖的甲殼質脫乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）在毛霉、根霉、曲霉和青霉等多種微生物中得以純化，為酶法生產殼聚糖奠定了基礎［7，10］，利用絲狀真菌制備殼聚糖必將成為一條大規模生產殼聚糖的有效途徑。本文通過單因素及正交實驗對黑曲霉產殼聚糖的發酵工藝進行了優化，為微生物發酵生產殼聚糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黑曲霉 天水師范學院生命科學與化學學院生物系保藏；酵母粉（OXOID）、蛋白胨（OXOID）、牛肉膏、瓊脂粉 北京奧博星生物技術有限公司；其它試劑均為分析純；基礎培養基及發酵條件 在含有4%葡萄糖，1%MgSO4，3%酵母粉和4%蛋白胨，自然pH的培養基上接種1mL 108個/mL黑曲霉菌懸液，裝液30mL于100mL發酵瓶中，放置在28℃，128r/min的恒溫搖床上進行發酵，3d后檢測殼聚糖含量。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化 采用PDA培養基。

1.2.2 黑曲霉孢子數測定 系列稀釋及血球計數法［11］。

1.2.3 殼聚糖的提取 參考葉龍祥的方法［12］并加以改進。取發酵液100mL在10000r/min的離心機上離心10min得菌體沉淀，加入重蒸水洗滌菌體沉淀至無色，稱菌體的濕重與干重，然后在所得沉淀中加入7%NaOH（菌體濕重∶堿=1∶10，g/mL），50℃下處理3h后離心，重蒸水洗滌沉淀至上清液無色；取上述沉淀，加入乙醇∶水=1∶1的20%NaOH溶液（菌體濕重∶堿 =1∶10，g/mL），與560W的微波爐處理10min，然后離心洗滌沉淀至上清液呈中性；接著取上述沉淀，加入5%乙酸（菌體濕重∶酸 =1∶15，g/mL），置于100℃的水浴鍋處理5h，離心分離，取上清液調節pH為8～10，直到出現大量白色沉淀為止，離心，用重蒸水洗滌沉淀至上清液呈中性，在50℃的真空干燥箱中干燥20min，得到白色固體，即為殼聚糖。1.2.4 殼聚糖產率計算

2 結果與分析

2.1 發酵時間對殼聚糖產率的影響

接種黑曲霉，濃度為108個/mL，接入1mL，置于28℃，128r/min的恒溫搖床上進行發酵，發酵時間分別為24、48、72、96h，每隔24h提取殼聚糖，進行比較分析，每一時間平行做3組，結果如表1所示。

表1 發酵時間對殼聚糖產率的影響

由表1可知，發酵72h與24、48h之間有顯著差異，而與96h之間沒有顯著性差異。隨著發酵時間的延長，殼聚糖產率先升高后降低，在72h殼聚糖產率最高，所以最佳發酵時間為72h。

2.2 溫度對殼聚糖產率的影響

將發酵溫度分別控制在23、25、27、29、31、33℃，轉速為130r/min培養72h，提取殼聚糖，進行比較分析，結果如表2所示。

表2 溫度對殼聚糖產率的影響

由表2可知，發酵溫度29℃與23、25、27、33℃之間有顯著性差異，29℃與31℃之間沒有顯著差異。隨著發酵溫度的升高，殼聚糖產率先升高后降低，在29℃時殼聚糖產率最高，最佳發酵溫度為29℃。

2.3 轉速對殼聚糖產率的影響

將發酵溫度控制在29℃，搖床轉速分別取120、125、130、135、140、145r/min，進行發酵培養72h，提取殼聚糖，進行比較分析，結果如表3所示。

表3 搖床轉速對殼聚糖產率的影響

由表3可知，發酵時搖床轉速130r/min與135、140、145r/min無顯著差異，而與120、125r/min有顯著差異，隨著轉速的增大，殼聚糖產率先升高后降低，在130r/min時殼聚糖產率最高，所以最佳搖床轉速為130r/min。

2.4 發酵培養基的優化

根據單因素實驗結果設計L9（34）正交實驗，其中四因素分別為培養基中葡萄糖、玉米漿和硫酸鎂的含量及黑曲霉接種量，結果如表4所示。

表4 基礎培養液正交實驗結果及極差分析

由表4極差分析可知，各因素影響殼聚糖產率的順序依次是：硫酸鎂＞玉米漿＞葡萄糖＞孢子量。可以確定最優發酵培養基配方為：70mL/L玉米漿，4%葡萄糖，1.2%硫酸鎂，8.0×108孢子量，在此培養條件下得到最高產率為18%。

3 結論

利用黑曲霉發酵生產殼聚糖，其產率受發酵溫度、轉速、時間、接種量和培養基成分及其pH等因素的影響。在考察單因素影響實驗中發現，發酵溫度控制在29℃以下，殼聚糖產率隨溫度的升高而增加；這是由于在一定的溫度范圍內，溫度的升高對菌株的生長和增殖具有一定的促進作用。搖床轉速為130r/min時，殼聚糖產率達到最大，繼續增大轉速，其產率呈下降趨勢；這是由于轉速過大破壞了菌絲體，影響后期菌體的收集。最佳發酵時間為72h，延長發酵時間，殼聚糖產率亦呈下降趨勢；這是由于培養初期菌絲體迅速生長，殼聚糖量也迅速積累，隨著培養時間的增加，殼聚糖量逐漸達到飽和，而菌絲體的量也不再增加，而且有一些菌絲面臨溶菌；另一方面，殼聚糖的相對分子質量隨著培養期的延長也會迅速下降。

通過上述一系列實驗得出黑曲霉發酵生產殼聚糖的最佳發酵工藝為：70mL/L玉米漿，4%葡萄糖，1.2%硫酸鎂，8.0×108孢子量，pH7.4～7.6，轉速為130r/min，29℃發酵72h的殼聚糖的產率最高。

［1］周文清，江堃.殼聚糖的研究進展［J］.景德鎮高專學報，2008，23（2）：46-48.

［2］李潤銘，鄧順周.甲殼素及殼聚糖在醫藥領域的應用研究進展［J］.食品與藥品，2007，9（12）：50-53.

［3］孫冀平.殼聚糖及其應用［J］.中國食品添加劑，2005（5）：83-86.

［4］翟榮玲，劉艷琴，孫豐林，等.殼聚糖應用研究進展［J］.山東畜牧獸醫，2008，29（9）：36-38.

［5］楊艾玲.殼聚糖的研究進展［J］.化工中間體，2009（10）：17-20.

［6］SHAHIDI F，ARACHCHI J K V，JEON Y-J.Food applications of chitin and chitosans［J］.Trends in Food Science& Technology，1999（10）：37-51.

［7］趙祥穎，劉麗萍，劉建軍.微生物甲殼質脫乙酰酶的研究進展［J］.食品與藥品，2008，10（7）：38-41.

［8］譚天偉，王炳武，陳鵬.生物法生產殼聚糖［J］.化工進展，2001（9）：4-5.

［9］NADARAJAH K，KADER J，MOHD MAZMIRA，et al. Production of Chitosan by Fungi［J］.Pakistan Journal of Biological Sciences，2001，4（3）：263-265.

［10］BANKS I R，SPECHT C A，DONLIN M J，et al.A Chitin Synthase and Its Regulator Protein Are Critical for Chitosan Production and Growth of the Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans［J］.EUKARYOTIC CELL，2005，4（11）：1902-1912.

［11］周德慶.微生物學實驗教程［M］.北京：高等教育出版社，2006.

［12］葉龍祥，劉清斌.黑曲霉發酵生產殼聚糖工藝研究［J］.化學與生物工程，2007，24（7）：45-48.

Optimization of technology of chitosan fermentation by Aspergillus niger

LI Yi-jing，WANG Ting-pu，MA Wei-chao，ZHANG Wen-ke
（College of Life Science&Chemistry，Tianshui Normal University，Tianshui 741001，China）

The optimum condition for chitosan fermentation by Aspergillus niger were studied by single factor and orthogonal experiments.The optimal conditions of chitosan production were as follows：70mL/L corn steep liquor，4g/L glucose，1.2g/L of magnesium sulfate，8.0×108spores，pH 7.4～7.6，130r/min，29℃ for 72h.There was a maximum productivity of chitosan 18%.

Aspergillus niger；chitosan；optimization

TS201.3

A

1002-0306（2010）12-0162-03

2010-05-14

李一婧（1981-），女，講師，主要從事天然產物生理生化分析研究。

天水師范學院研究基金資助（TSA0920）。