黑曲霉固態混菌發酵蘋果渣生產多酶生物飼料

莊童琳，李 虎，郭鳳霞，孫中濤

（1.甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅蘭州730070；2.泰安嘉元生物工程公司，山東泰安271000；3.山東農業大學生命科學學院，山東泰安271018）

黑曲霉固態混菌發酵蘋果渣生產多酶生物飼料

莊童琳1，李 虎2，郭鳳霞1，孫中濤3，*

（1.甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅蘭州730070；2.泰安嘉元生物工程公司，山東泰安271000；3.山東農業大學生命科學學院，山東泰安271018）

蘋果渣是一類產量巨大而目前尚未充分利用的農業廢棄物資源，其綜合利用不僅可產生巨大的經濟效益，而且還可以減少環境污染，具有顯著的社會效益。本文采用兩株黑曲霉對蘋果渣進行固態混菌發酵生產多酶生物飼料，同時提高蛋白質與氨基酸含量，改善其營養價值。研究結果表明，采用蘋果渣棉粕1∶1（w/w）、（NH4）2SO41%（w/w）、KH2PO40.1%（w/w）為最佳培養基，黑曲霉F2與F3最佳配比為2∶1（w/w），接種量0.4%（w/w），30℃恒溫培養48h，蛋白酶和纖維素酶活力分別為3674U/g和1207U/g，果膠與單寧的降解率分別為99.0%和66.1%，同時，蛋白質與氨基酸的含量提高，可溶性糖含量降低，營養價值得到全面的改善。

蘋果渣，多酶生物飼料，抗營養因子，蛋白酶，纖維素酶

我國每年在蘋果加工過程中排出蘋果渣約100多萬t，目前僅有25%～30%用于肥料、燃料、飼料或其他用途，而70%～75%因無法利用而廢棄，幾天內就腐爛變質發出酸臭味，嚴重污染環境［1］。美國、印度等其它國家情況也基本類似［2］。因此，蘋果渣的綜合利用引起了國內外學者的普遍關注。目前，最可行的蘋果渣綜合利用方法是作為反芻動物的飼料，但以下幾個因素嚴重制約著其應用效果：第一，蘋果渣中蛋白質、維生素、礦物質等含量很低，營養水平較低；第二，蘋果渣中果膠、單寧等抗營養因子含量較高，直接影響動物的攝食量和飼料的消化利用率；第三，蘋果渣中低分子糖類含量較高，會在動物瘤胃中發酵產氣，引起胃脹噯氣等不適。因此，直接飼用時效果欠佳［3］。國內外許多學者采用微生物發酵的方式對蘋果渣的飼用價值進行改良，普遍采用的微生物是酵母菌類和絲狀真菌，擔子菌等大型真菌也有報道，但其研究目標都集中于提高蘋果渣的蛋白質含量，沒有涉及抗營養因子的降解與低分子糖類的轉化［1，4-6］。其實，微生物對蘋果渣的發酵過程中，在菌體生長的同時，會產生大量的水解酶類，對果膠、單寧等抗營養因子進行一定程度的降解。水解酶類的分泌水平與抗營養因子的降解程度取決于微生物種類與發酵方式。本文采用兩株酶系互補的黑曲霉對蘋果渣進行固態混菌發酵生產多酶生物飼料，以酶系組成與酶活力水平為指標對生產工藝進行了優化，同時對果膠與單寧等抗營養因子的生物降解、低分子糖類的轉化、蛋白質與氨基酸含量的提高水平等進行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黑曲霉F1、F2（Aspergillus niger F1、F2） 系從長期堆積的蘋果渣中分離獲得，具有較高的纖維素酶產量，適合以蘋果渣為原料進行生長繁殖；黑曲霉F3（Aspergillus niger F3）、米曲霉 F4（Aspergillus oryzae F4） 由山東信德利生物工程公司提供，具有較高的蛋白酶產量；蘋果渣 煙臺紅富士蘋果榨汁后所得殘渣；棉粕 棉籽浸油后所得到的殘渣，蘋果渣與棉粕粉碎后，收集粒度為30～50目的組分備用；果膠、木聚糖 購自Sigma公司；基礎培養基 取蘋果渣與棉粕的混合物（1∶1，w/w）15g，裝入250mL三角瓶，121℃濕熱滅菌20min，自然冷卻；其余試劑 均為國產分析純。

1.2.1 培養方法 向培養基中以0.5%（w/w）的接種量接入黑曲霉孢子，30℃恒溫培養48h，于24、36h各搖瓶一次，發酵完畢，置于通風干燥箱中50℃干燥24h，磨碎，過80目篩，備用。

1.2.2 單因素實驗設計 在基礎培養基上，采用不同的菌株組合與配比進行固態發酵實驗，然后測定各種酶的酶活力，以確定最佳菌株組合與配比。采用不同配比的蘋果渣與棉粕混合物為培養基，以0.5%（w/w）的接種量接入黑曲霉F2與F3（2∶1，w/w）進行固態混菌發酵，然后測定各種酶活力，以確定蘋果渣與棉粕的最佳配比。在此基礎上，按干料的1%（w/w）分別添加不同的無機氮源，發酵后測定各種酶活力，以確定最佳無機氮源的種類。

1.2.3 正交實驗設計 為確定培養基含水量、裝料量、（NH4）2SO4與K2HPO4等因素對產酶的影響及其最佳水平，在單因素實驗的基礎上，采用四因素三水平的正交實驗對培養基進行優化，其因素與水平見表1。以0.5%（w/w）的接種量接入黑曲霉F2與F3（2∶1，w/w）進行固態混菌發酵，然后測定各種酶活力。實驗不設空白列，每組實驗做3個平行，重復2次，以重復實驗誤差作為方差分析的實驗誤差。

1.2.4 接種量、溫度與pH等發酵條件對產酶的影響采用所優化的最佳培養基進行單因素實驗，僅改變接種量，于30℃培養48h，以確定最佳接種量；采用所確定的最佳接種量，僅改變培養溫度或基質的pH，以確定最佳培養溫度與pH。固態基質的pH調節比較困難，本實驗采用鹽酸或氫氧化鈉對基質的pH進行調節，基質的自然pH約為5.0。

表1 正交實驗因素與水平表

1.2.5 發酵時間對菌體生長與酶活力的影響 采用所優化的最佳培養基和最佳發酵條件進行固態發酵。每隔12h取出3瓶，于50℃干燥24h，混合均勻，然后測定干曲酶活力和干重減重。

1.2.6 分析方法 蛋白酶活力測定采用福林法［7］，在40℃、pH5.0的條件下，每分鐘水解酪蛋白產生1μg酪氨酸所需的酶量為1個蛋白酶活力單位，以U/g干曲表示。纖維素酶活力測定采用DNS顯色法［8］，在40℃、pH5.0的條件下，1h水解羧甲基纖維素產生1mg葡萄糖所需的酶量為一個纖維素酶酶活單位，以U/g干曲表示。果膠酶活力測定采用DNS顯色法［9］，在40℃、pH5.0的條件下，1min分解果膠產生1mmol半乳糖醛酸所需的酶量為一個果膠酶酶活單位，以U/g干曲表示。木聚糖酶活力測定采用DNS終止法［10］，在40℃、pH5.0的條件下，每分鐘水解木聚糖生成1mmol還原糖所需的酶量為一個酶活力單位，以 U/g干曲表示。甘露聚糖酶活力測定采用DNS終止法［11］。在40℃、pH5.0的條件下，每分鐘水解角豆膠生成1mmol還原糖所需的酶量為一個酶活力單位，以U/g干曲表示。單寧酶活力測定采用比色法［12］，在40℃、pH5.0的條件下，每分鐘水解1mmol單寧所需的酶量為一個酶活力單位，以 U/g干曲表示。

果膠含量的測定采用重量法［13］，單寧含量的測定采用K3Fe（CN）6法［14］，自由棉酚的測定采用間苯三酚比色法［15］?？扇苄蕴堑臏y定采用 DNS比色法［16］，粗蛋白與精蛋白的測定采用凱氏定氮法［17］。

2 結果與分析

2.1 菌種及其配比對產酶的影響

（1）薇甘菊頸盲蝽PmGSTd1是屬于GST delta家族的一個分泌蛋白，與溫帶臭蟲（Cimex lectularius）GST的親緣關系最近。

如圖1所示，不同的菌種組合與配比對酶系組成與酶活力影響很大，F1菌株單獨發酵時纖維素酶活力最高，可達1495U/g，但蛋白酶活力很低；F3菌株單獨發酵時蛋白酶活力最高，可達3681U/g，但纖維素酶活力很低。與單菌發酵相比，混菌發酵時的蛋白酶與纖維素酶活力都不是最高的，但酶系組成得到了改善，其中以黑曲霉F2與黑曲霉F3以2∶1（w/w）的比例混菌發酵所產生的蛋白酶與纖維素酶的活力均較理想，且總酶活力最高。因此，本研究選定黑曲霉F2與黑曲霉F3（2∶1，w/w）作為最佳菌種組合與配比。

2.2 蘋果渣與棉粕配比對產酶的影響

如圖2所示，蘋果渣與棉粕配比為3∶7（w/w）時，蛋白酶產量最高；而配比為5∶5（w/w）時，纖維素酶活力最高。如果僅考慮酶活力，蘋果渣與棉粕的最佳配比是4∶6（w/w），但棉粕價格遠高于蘋果渣，且飼料中纖維素酶等NSP酶的活力往往是限制性因素，因此，綜合考慮酶系組成與原料成本，我們采用5∶5（w/w）作為最適配比。

表2 正交實驗結果及其極差與方差分析

圖1 菌種及其配比對蛋白酶與纖維素酶酶活力的影響

圖2 蘋果渣與棉粕配比對蛋白酶與纖維素酶酶活力的影響

2.3 無機氮源對產酶的影響

如圖3所示，添加不同種類的無機氮源均可提高干曲的酶活力，其中以（NH4）2SO4效果最好。（NH4）2SO4與NH4NO3對蛋白酶的影響達到了顯著水平（P＜0.05），而NaNO3與NH4Cl的影響并不顯著（P＞0.05）；（NH4）2SO4與NH4Cl對纖維素酶的影響達到了顯著水平（P＜0.05），而NaNO3與NH4NO3的影響并不顯著（P＞0.05）。

2.4 培養基優化正交實驗

圖3 無機氮源對產酶的影響

正交實驗結果與分析如表2所示，極差分析結果表明，蛋白酶生產的最佳培養基組合為A2B2C2D1，纖維素酶生產的最佳培養基組合為A2B2C2D2。方差分析表明，因素A與B對兩種酶產量的影響均十分顯著（P＜0.01），其最佳水平均為第二水平；因素C對蛋白酶與纖維素酶影響不顯著；因素D對蛋白酶影響十分顯著（P＜0.01），最佳水平均為D1，對纖維素酶影響顯著（P＜0.05），最佳水平為D2。綜合考慮各因素對兩種酶影響的顯著程度，我們采用A2B2C1D1為最佳培養基組合，即蘋果渣與棉粕（1∶1，w/w）的初始含水量55%（w/w），（NH4）2SO41%（w/w）、K2HPO40.1%（w/w）、裝料量 15g干料/ 250mL三角瓶。

2.5 接種量、溫度、pH等發酵條件對產酶的影響

分別以不同的接種量、培養溫度與pH做單因素實驗，結果見表3。接種量為0.4%（w/w）時，兩種酶的產量最高。27℃培養時，蛋白酶的酶活力最高，但與30℃培養時的酶活力并無顯著差異（P＞0.05）；30℃培養時，纖維素酶的酶活力最高，且與27℃培養時的酶活力差異顯著（P＜0.05），因此，我們采用30℃為最適培養溫度。蛋白酶與纖維素酶的培養基最適初始pH均為5.0。

表4 多酶飼料的酶系組成

表3 接種量對產酶的影響

表4 溫度對產酶的影響

表5 初始pH對產酶的影響

2.6 發酵時間對菌體生長與酶活力的影響

固態發酵的菌體生長量不能直接測定，但菌體生長量與基質干重減少量呈正相關，因此，可用基質干重減重來間接反映菌體的生長情況［18］。實驗結果見圖4，圖中蛋白酶與纖維素酶的100%相對酶活力分別為3393U/g與1454U/g。結果表明，前12h，菌體生長處于延遲期，基質干重減重甚微，幾乎沒有蛋白酶與纖維素酶產生；12～36h為菌體的快速生長期，在其前期（12～24h）蛋白酶與纖維素酶有少許產生，在其中后期（24～36h）兩種酶大量產生；36～48h是菌體生長的減速期，此階段兩種酶仍然大量生成；48h后菌體生長緩慢，雖然此后酶活力仍然在緩慢增加，但考慮到48h后孢子大量產生，不利于產品性狀，因此，最佳發酵時間為48h。

圖4 發酵時間對菌體生長與酶活力的影響

2.7 多酶飼料的酶系組成

如表4所示，所生產的多酶飼料酶系比較豐富，除纖維素酶與蛋白酶外，還有果膠酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶與單寧酶存在。蛋白酶、纖維素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶等有助于提高飼料中蛋白質、纖維素與半纖維素等營養成分的消化利用率。果膠與單寧是植物源飼料中普遍存在的抗營養因子，多酶飼料中的果膠酶與單寧酶有助于分解這些抗營養因子，消除其抗營養作用，有利于提高飼料的消化利用率。

2.8 發酵前后可溶性糖、蛋白質與氨基酸含量的變化

由表5可知，發酵后基質的可溶性糖含量大幅度下降，蛋白質與氨基酸含量大幅度提高，粗蛋白與精蛋白含量分別提高40.8%與34.7%，氨基酸總量與必需氨基酸含量分別提高46.8%與71.7%，其中蛋氨酸、賴氨酸與蘇氨酸的含量分別提高83.6%、51.3%與98.7%，這標志著飼料的營養價值大幅度提高。

果膠與單寧是蘋果渣中的主要抗營養因子，發酵過程中果膠與單寧被微生物降解，降解率分別達到99.0%與66.1%。棉酚是棉粕中存在的最主要抗營養因子，在濕熱滅菌與發酵過程中，自由棉酚與蛋白質等物質結合轉化為結合棉酚，失去了毒性［19］，發酵后，自由棉酚含量由最初的357μg/g下降到23μg/g，遠低于國家規定的飼料中自由棉酚含量的安全標準（100μg/g），因此，采用棉粕作氮源是安全的。

表5 發酵前后基質營養成分的變化

3 結論

采用兩株黑曲霉對以蘋果渣和棉粕為基礎培養基進行固態混菌發酵生產多酶生物飼料，通過單因素實驗和正交實驗得到最佳發酵條件：蘋果渣與棉粕比例為1∶1（w/w），（NH4）2SO41%（w/w），KH2PO40.1%（w/w），黑曲霉 F2與 F3最佳配比為 2∶1（w/w），接種量0.4%（w/w），pH5.0，30℃恒溫培養48h。在最佳發酵條件下，產生多種水解酶類，其中蛋白酶和纖維素酶活力分別為3674U/g和1207U/g；果膠與單寧的降解率分別為99.0%和66.1%；蛋白質與氨基酸的含量提高，可溶性糖含量降低。實驗證明黑曲霉固態混菌發酵對蘋果渣的綜合利用是一個有效的生物轉化方式，在產生多種水解酶類、提高蛋白質含量的同時，降解蘋果渣中的抗營養因子，改善飼料的飼用價值。這種黑曲霉固態混菌發酵體系，同樣也適用于其它水果皮渣等類似農業廢棄物的綜合利用。

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Production of bio-feed enriched of enzymes from apple pomace in solid state fermentation by Aspergillus niger

ZHUANG Tong-lin1，LI Hu2，GUO Feng-xia1，SUN Zhong-tao3，*
（1.College of Life Sciences and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou 730070，China；2.Tai’an Jiayuan Biotechnology Limited Company，Tai’an 271000，China；3.College of Life Sciences，Shandong Agricultural University，Tai’an 271018，China）

The objectives of this work were to produce bio-feed enriched of enzymes，biodegrade pectin and tannins，the main anti-nutritional factors in apple pomace，and to improve the nutritional level of the fermented substrate.Activities of proteinase and cellulase were 3674U/g and 1207U/g，and the biodegradation rates of pectin and tannins were 99.0%and 66.1%，respectively，when the optimum medium，the mixture of apple pomace and cottonseed powde（r1∶1，w/w），supplemented with 1%（w/w）（NH4）2SO4and 0.1%（w/w）KH2PO4，was inoculated with 0.4%（w/w）of Aspergillus niger F2 and F3（2∶1，w/w）and incubated at 30℃for 48h in solid state fermentation. The utilization of apple pomace in the paper was the most efficient biological treatment and could become a model for the value addition of similar wastes.

apple pomace；multienzyme bio-feed；anti-nutritional factor；proteinase；cellulase

TS255.1

A

1002-0306（2010）12-0171-05

2009-11-04 *通訊聯系人

莊童琳（1984-），女，碩士研究生，研究方向：植物資源利用。

山東省科技攻關計劃（2005GG1109002）。