蓮藕腐敗病病原菌致病性及遺傳差異性的研究

梁志懷，魏林，安哲宇

（1.湖南省植物保護研究所，湖南長沙，410125；2.中南大學研究生院隆平分院）

蓮藕是近幾年農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)優(yōu)化調(diào)整、生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要水生蔬菜之一，大田種植、池藕開發(fā)已成為農(nóng)民增收的主要經(jīng)濟來源。蓮藕腐敗病為蓮藕生產(chǎn)上的主要病害，給蓮藕生產(chǎn)造成較大的損失，嚴重的可使蓮藕商品價值減少60%以上[1]。由于藕農(nóng)常習慣于周年和連年的重茬種植，該病的發(fā)生有逐年加重的趨勢。蓮藕腐敗病的初侵染源是帶菌的種藕和帶病的土壤，最初發(fā)病受害部位為地下莖，不易觀察，常失去最佳防治時期，化學防治收效不大。因此，利用抗病品種是防治蓮藕腐敗病最為有效的措施，這就有必要確定腐敗病菌的致病力與優(yōu)勢種群。本文研究確定了測定蓮藕腐敗病菌致病性的快速、準確、簡便鑒定的方法，并對供試菌株間的致病性分化與遺傳背景間差異性的關(guān)系作了初步分析，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

選取蓮藕腐敗病主要致病菌鐮刀菌作為供試菌株，7個鐮刀菌菌株中有5個菌株為不同區(qū)域發(fā)病藕上分離、純化培養(yǎng)獲得，另2個菌株為從百合、黃瓜枯萎病病株上分離、純化培養(yǎng)獲得。7個供試菌株來源分別為 F1：長沙縣藕田病株；F2：湘鄉(xiāng)藕田病株；F3：超市病藕；F4、F5：長沙市菜市場病藕；F6：百合枯萎病株；F7：黃瓜枯萎病株。

1.2 供試藕塊

從藕田里取長勢較為一致的健康嫩藕節(jié)，取中間段6 cm，從中間縱切后供試。

1.3 不同接種方法測定供試病原菌致病性[2，3]

①病原菌菌絲牙簽接種 接種物培養(yǎng)：將供試鐮刀菌移植于PDA培養(yǎng)基平板上，于25℃下恒溫培養(yǎng)4～5 d，備用；選用軟木質(zhì)牙簽，水煮2～3次（防止牙簽上的化學酚類物質(zhì)等抑制鐮刀菌的生長），每次煮1 h，煮后用清水沖洗2～3次，晾至半干后將牙簽尖部輕放于裝有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，牙簽的尾部用滅菌的直徑0.5 cm的濾紙托起，每皿放3根，將7個供試鐮刀菌菌塊（0.5 cm×0.5 cm）分別接種于培養(yǎng)皿的中央，置于25℃下培養(yǎng)，使病原菌從培養(yǎng)基向牙簽上蔓延生長，當牙簽從尖部被病原菌覆蓋至牙簽的1/4后，用于供試藕塊的接種。

病原物接種：先用滅菌的大號注射針頭在藕塊要接種的部位刺1 cm深（防止直接用牙簽插入時附著在牙簽上的病原菌脫落），再將帶菌牙簽插入藕塊接孔中，每孔接牙簽2根，每藕塊接3個孔。接種后的藕塊置于（26±1）℃溫度條件下的培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。

②病原菌菌絲塊接種 藕塊接種：將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的各供試鐮刀菌用7 mm無菌打孔器在無菌的條件下，自菌落邊緣切取菌餅，用接種器將菌餅接種于藕塊的中央，菌絲面朝下，每藕塊接種1個菌餅，接種后將藕塊置（26±1）℃溫度條件下的培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。

藕葉接種：配置植物營養(yǎng)液，將初展的嫩葉插入裝有基本植物營養(yǎng)液的燒杯中，將藕塊接種中制備的菌絲塊接種在葉片距邊緣8 cm處，相距10 cm放置1塊，菌絲塊上放置滅菌的棉花團保濕，再將藕葉連同燒杯置（26±1）℃溫度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以接種不含菌絲體的等體積瓊脂塊為對照。

③病原菌孢子懸浮液接種 病原菌孢子懸浮液的制備：將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的各供試菌株的菌絲體，加適量的無菌水清洗，用4層滅菌紗布過濾后，用無菌水將孢子量調(diào)整為1×108個/mL，制備成供試孢子懸浮液。

藕塊接種：將縱切的藕塊置于保濕的培養(yǎng)皿內(nèi)，每藕塊均勻噴霧15 mL孢子懸浮液，置于（26±1）℃溫度條件下的培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。以噴霧蒸餾水為對照。

藕葉接種：采用與藕塊接種的相同方法處理藕葉，將孢子懸浮液均勻地噴霧于葉片上，接種后的葉片連同燒杯置于（26±1）℃溫度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以噴霧蒸餾水為對照。

不同菌株藕塊接種15塊，葉片接種6片。9 d后記錄各處理發(fā)病率；按調(diào)查的病級數(shù)，計算病指。

1.4 病害發(fā)病分級標準

根據(jù)腐敗病在蓮藕葉片、地下莖的發(fā)病特點，確定病害發(fā)病分級標準。

①接種藕塊病級分級標準 0級：藕塊生長正常、完好；1級：藕塊有輕微病變，病變尚未侵入藕塊組織；2級：藕塊組織有明顯病變，維管束呈褐色；3級：藕塊維管束呈深褐色，變色部分占總面積的10%以下；4級：變色部分占藕塊總面積的10%～30%；5級：變色部分占藕塊總面積的30%以上。每個藕塊為一計量單位。

②接種葉片病級分級標準 a.菌絲塊接種葉片。0級：葉片上未見癥狀；1級：淺褐色病斑環(huán)在葉片上擴展 0～3.0 cm；3 級：水浸狀病斑環(huán)在葉柄上擴展 3.0～3.5 cm；5 級：水浸狀病斑環(huán)在葉柄上擴展 3.5～4.0 cm；7 級：水浸狀病斑環(huán)在葉柄上擴展 4.0～4.5 cm；9 級：水浸狀病斑環(huán)在葉柄上擴展4.5 cm以上。以每個菌絲塊為一計量單位。

b.孢子懸浮液噴霧接種葉片。0級：無病癥；1級：接種葉出現(xiàn)可見的褪綠小點或黃色小點；2級：接種葉出現(xiàn)1～5個黑色斑點；3級：接種葉上出現(xiàn)10個黑色斑點或葉尖出現(xiàn)黑斑；4級：接種葉上出現(xiàn)11～15個黑色斑點；5級：接種葉上出現(xiàn)16～20個黑色斑點；6級：接種葉上出現(xiàn)20個以上黑色斑點。整個葉片十字交叉分為4等份，每1份為1個計量單位。

1.5 供試病原菌遺傳差異性分析

①供試病原菌菌絲體的培養(yǎng) 在PDA平板上培養(yǎng)5 d的供試菌株菌落邊緣取10 mm×10 mm的菌絲塊，轉(zhuǎn)入100 mL的PD液體培養(yǎng)基中，25℃條件下?lián)u床120 r/min震蕩培養(yǎng)6 d，真空抽濾獲得菌絲體后，分別用無菌水和滅菌的生理鹽水洗滌2次后，45℃烘干備用。

②DNA的提取 具體操作參照曹宜等方法[4]，略作修改。

③引物篩選和RAPD擴增 從18條擴增條帶數(shù)量適中、條帶清晰可辨的隨機引物（均由上海生工生物公司合成）中，進一步篩選出主帶明顯、穩(wěn)定的3條隨機引物作為試驗用引物。其引物序列分別為：S6 5'TGCCGAGCTG 3'；S11 5'TGGACCGGTG 3'；S16 5'AGATGCAGCC 3'。

PCR反應(yīng)體系總體積為25 uL。其中：模板DNA 1 μL（50 ng），隨機引物 1 μL（約 5 pmol），10×PCR Buffer（含 Mg2+） 2.5 μL，dNTP 2 μL，Taq 酶 1 單位（U）0.5 U，加 ddH2O 至 25 μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃ 預(yù)變性4 min； 循環(huán)：94℃變性30 s,37℃退火30 s，72℃ 延伸1 min，共35輪循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后,72℃ 延伸8 min，16℃保溫。

檢驗： 取 PCR 產(chǎn)物 7.5 μL 加 2.5 μL 上樣緩沖液于2% 瓊脂糖膠（含0.5 μg/mL溴化乙錠） 上穩(wěn)壓100～110 V電泳1.5 h。紫外檢測儀觀察、拍照。

④數(shù)據(jù)分析 根據(jù)供試菌株RAPD-PCR擴增條帶的有無，以1，0記數(shù)。統(tǒng)計穩(wěn)定、清晰的條帶，采用DPS統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試病原菌不同接種方法對寄主發(fā)病的影響

試驗中采用5種方法對供試病原菌進行人工接種，接種藕塊和葉片發(fā)病情況表明，所有接種方法都可導(dǎo)致接種體發(fā)病，且人工接種植株的感染癥狀與大田中自然發(fā)病的相同，在接種病株的再分離中所得病原菌的形態(tài)和培養(yǎng)性狀與接種菌完全一致。

供試藕塊和葉片發(fā)病情況見表1。如表1所示，所有供試菌株中以菌絲塊對藕塊接種所致發(fā)病率最高，且發(fā)病最嚴重，病情指數(shù)最高。用病原菌菌絲體牙簽接種，藕塊的發(fā)病率雖然也較高，但與菌絲塊接種相比，無顯著差異，但接種藕塊的發(fā)病嚴重度則低于菌絲塊接種。孢子懸浮液噴霧接種，則是葉片接種的較好方法，該方法接種病原菌后，葉片的發(fā)病率及發(fā)病程度均高于藕塊的。試驗結(jié)果還表明，不同接種方法，接種物出現(xiàn)癥狀的時間不同，菌絲塊接種的藕塊4 d左右即出現(xiàn)典型的癥狀，孢子懸浮液噴霧接種的葉片6 d左右才出現(xiàn)典型的癥狀。

表1 供試病原菌不同接種方式的發(fā)病程度

試驗結(jié)果表明，用藕塊進行腐敗病病原菌致病性測定時，可選擇病原菌菌絲塊接種的方法；用藕葉進行測定時，可選擇孢子懸浮液噴霧接種的方法。綜合考慮接種物發(fā)病嚴重度，病情調(diào)查時記數(shù)的復(fù)雜性和接種后保濕效果好壞等因素，最適宜的方法應(yīng)首選藕塊菌絲塊接種測定的方法。

2.2 不同來源病原菌對寄主致病性存在著分化

試驗中所采用的5種接種方法測定蓮藕腐敗病菌的致病力，試驗表明，供試的7個菌株間的致病力均表現(xiàn)出差異性，存在明顯的致病性分化，但這種菌株間致病力差異與菌株地域來源并未表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。并且，各供試菌株在不同接種方法下，其所表現(xiàn)出的致病力強度具有一致性，如F1菌株，其在5種不同接種方法下，均表現(xiàn)出較強的致病力；F6菌株在5種接種方法下，致病力表現(xiàn)得都較弱。從表1中還看出，從發(fā)病的藕塊上分離的鐮刀菌菌株對藕塊、葉片致病力較強；從百合、黃瓜上分離獲得的鐮刀菌菌株對供試藕塊、葉片也具有一定的侵染性。

2.3 不同來源病原菌遺傳多樣性

引物S16對6個供試鐮刀菌病原菌菌株的RAPD擴增圖譜見圖1，根據(jù)擴增出的譜帶繪制的聚類樹狀圖。可以看出，來自同一植株（蓮藕）的鐮刀菌菌株間既有共同的特征性譜帶，又有自己特異性的譜帶，菌株間存在著較大的遺傳多態(tài)性。這種多態(tài)性似乎同地域沒有關(guān)系。如分離自湘鄉(xiāng)藕田病株的病原菌與分離自超市病藕的病原菌遺傳相似性非常高（但超市病藕產(chǎn)地不詳）；與分離自長沙病株上的病原菌則存在較大的遺傳距離。而來自百合和黃瓜兩寄主的鐮刀菌，與來自蓮藕寄主的鐮刀菌菌株多存在較大的遺傳差距。

圖1 引物S16對供試鐮刀菌的RAPD擴增圖譜

3 小結(jié)與討論

筆者初步摸索了蓮藕腐敗病菌（鐮刀菌）致病性測定的室內(nèi)人工接種方法。結(jié)果表明，病原菌菌絲塊對嫩藕藕塊接種，可達到發(fā)病率高、發(fā)病程度高的效果，這為鑒定我國蓮藕主產(chǎn)區(qū)不同致病菌之間的小種差異、蓮藕抗病性品種的篩選提供了簡便、易行、準確的抗性鑒定人工接種方法，但這種實驗室內(nèi)病原菌與藕塊單純的一對一的互作結(jié)果所篩選出的蓮藕對病原菌的抗性與田間表現(xiàn)是否一致，還需要進一步研究。

試驗結(jié)果表明，不同蓮藕腐敗病鐮刀菌病原菌間致病力表現(xiàn)出了一定差異，對供試菌株基因組DNA應(yīng)用RAPD技術(shù)進行多態(tài)性分析，結(jié)果表明，各菌株間存在一定的遺傳多態(tài)性，因此確定蓮藕主栽區(qū)腐敗病致病菌是否存在生理小種的分化及其強致病性生理小種的篩選，對該病害的有效防治及抗病品種的選育，就顯得尤為重要。此外，非蓮藕寄主中分離獲得的鐮刀菌對蓮藕也具有一定的侵染能力，能引起蓮藕腐敗病，在對蓮藕腐敗病進行防治及耕作時應(yīng)對這些因素加以考慮。