混合發酵生產饅頭菌種的篩選

胡麗花，蘇東民，蘇東海，辛秀蘭

（1.河南工業大學，河南鄭州450052；2.北京電子科技職業學院，北京100029）

混合發酵生產饅頭菌種的篩選

胡麗花1，蘇東民1，蘇東海2，*，辛秀蘭2

（1.河南工業大學，河南鄭州450052；2.北京電子科技職業學院，北京100029）

傳統饅頭制作屬于自然雜菌混合發酵，傳統發酵使其具有獨特風味。本研究主要是從傳統的饅頭發酵劑中篩選性能優良，適于饅頭混合發酵的酵母菌和乳酸菌。通過對采集到的14個樣品中的微生物進行分離、篩選、復篩，篩得性能較好的酵母菌和乳酸菌各15株，酵母菌中尤以Sq4-3、Sq7-2、Sq9-2、Sq9-4和JZ1-4的發酵性能最好。最后挑選酵母菌Sq4-3與5株代表性乳酸菌進行饅頭混合發酵實驗，結果表明不同乳酸菌對饅頭品質的影響不同，其中添加Sq2.2的酸面團發酵的饅頭總體感官評分最高，為7.56分。

乳酸菌，酵母菌，篩選，饅頭

自從面包酵母被發明和使用以來，因其方便性而逐漸取代了傳統面食發酵劑。傳統面食發酵劑的使用雖然存在缺陷，但其混合菌種發酵使成品具有獨特風味或特殊功能［1］。近年來國外對傳統發酵劑酸面團的研究表明：酸面團的微生物為酵母菌和乳酸菌，應用酸面團能夠改善面包的風味和質構，增加營養價值，延長貨架期等［2］。我國傳統主食發酵劑資源豐富，很有必要對我國傳統主食發酵劑進行系統研究。本文的目的是根據菌種的形態特征、生化特性從采集到的傳統饅頭發酵劑中分離、篩選出性能優良且適于混合發酵饅頭的酵母菌和乳酸菌。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

樣品 河南省商丘和焦作的14個酵子樣品；小麥粉 北京大磨坊面粉有限公司；培養基 綜合馬鈴薯培養基、麥芽汁培養基、MRS培養基。

LDZX-40BI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫療器械廠；Model 9960A Ultrasonic cleaners CBL photoelectron TECHNOLOGY；超凈工作臺 北京昌平長城空氣凈化工程公司；HPS-250生化培養箱 哈爾濱市東明醫療儀器廠；WJ-160A-Ⅱ二氧化碳細胞培養箱 上海新苗醫療器械制造有限公司；3K15高速離心機 Sigma。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的采集 從河南省商丘市采集11個樣品標號為Sq1～11；來自河南省焦作孟州得3個樣品編號為JZ1～3。將樣品裝入無菌瓶中，0～4℃保存。

1.2.2 微生物計數 各取樣品1g分別加入到99mL無菌水中，超聲波振蕩20min，用無菌移液管準確吸取上清液1mL，加無菌水9mL進行稀釋，10倍等梯度稀釋法至10-7，分別取10-4，10-5，10-6，10-7濃度梯度稀釋液各0.1mL，分別涂布于綜合馬鈴薯培養基、麥芽汁瓊脂和MRS培養基平板，每個梯度做2個平行，于28、28、30℃倒置培養72h，進行計數［3］。

1.2.3 菌種分離和篩選

1.2.3.1 酵母菌的分離和篩選 酵母菌的分離與篩選用含0.5g/L氯霉素的麥芽汁瓊脂培養基，從菌落特征明顯的單菌落上挑起少許移植于斜面培養基，于28℃恒溫培養72h，進行第1次純化。挑取純化后的菌落少許劃線接種于分離培養基，28℃恒溫培養72h，進行第2次分離。按照第1次純化操作進行第2次純化，鏡檢。將采用連續劃線分離純化的菌種用麥芽汁瓊脂斜面4℃保藏［3］。

1.2.3.2 乳酸菌的分離和篩選 每一樣品系列稀釋度的菌懸液接種于MRS瓊脂平板，由MRS瓊脂培養基的自動篩選進行分離。MRS瓊脂培養基，添加還原劑（L-半胱氨酸鹽酸鹽0.1%，W/V），滅過菌后傾注平板前加入無菌放線菌酮稀釋液（0.01%，W/V）抑制酵母菌的生長［4-5］，5%CO2，30℃，培養72h［6］。分離菌株根據以下篩選標準確定：形態觀察、革蘭氏反應、過氧化氫酶反應，同型或異型發酵，15～45℃的生長情況。桿菌或球菌、革蘭氏陽性（紫）、過氧化氫酶陰性（無氣泡）為乳酸菌［5］。

1.2.4 菌種的復篩

1.2.4.1 酵母菌的復篩 發酵性能：采用杜氏管發酵法，將分離純化后的酵母菌接種于麥芽汁培養基中，置于28℃恒溫培養箱中培養24h，測定酵母菌株產氣泡的快慢、在規定時間內產氣泡的多少及產生氣味的濃度和類型，初步比較各株酵母菌的起酵能力、發酵能力及產香能力，初篩出性能優良的酵母菌［3］。菌株特性：進行耐酸能力實驗，將酵母接入麥芽汁培養基中，將麥芽汁培養基的pH用1mol/L的H2SO4調pH分別為3.2、4.2、5.2和6.2；滅菌后，按2%接種量接入活化好的酵母菌，28℃培養10h，于波長660nm處測OD值，確定其耐酸能力［3］。

1.2.4.2 乳酸菌的復篩 乳酸菌產酸、產味實驗：向含有5%面粉的無菌溶液中接入1%過夜培養的乳酸菌培養液，30℃培養24h，用pH計測酸度［5］，同時檢查其產味情況。

1.2.5 混合發酵實驗

1.2.5.1 菌種和老面團制備 取新鮮培養酵母菌種和乳酸菌的斜面菌種一環，分別接種到裝有20mL無菌麥芽汁和MRS液體培養基，28℃和30℃培養24h。然后接種到裝有100mL上述培養基的三角瓶，同上培養24h后，于4℃、5000×g離心15min，除去上清液，獲得微生物的細胞溶于無菌生理鹽水，用于饅頭實驗。

2000mL大燒杯中600g水，400g面粉混合，LAB和/或酵母的接種量為 105～106cfu/g，24℃，發酵12h［7］。

1.2.5.2 發酵饅頭及評價 采用軟式主食饅頭發酵方法：按面團的20%添加酸面團，同時添加面包酵母0.5%［7-8］。50g酸面團，20mL水，0.5g燕子牌即發干酵母，70g饅頭專用粉，用手混勻后，形成光滑完整的面團。將面團置于溫度為32±2℃、相對濕度為85%的醒發箱中發酵40min。取出添加10g面粉揉成半圓型面團，同以上發酵條件醒發20min。采用Φ33cm的不銹鋼鍋，加入1800mL水，加熱至沸騰后將饅頭坯放在蒸箅上，蓋嚴，沸水汽蒸20min，停火2min后，取出饅頭。20min后對其體積、外表狀況、內部組織結構、香味、口感進行感官評價［9］。

2 結果與討論

2.1 微生物計數

由于地理位置及存儲時間的不同，不同樣品的活菌數不同，酵母菌的活菌數106～109cfu/g不等，乳酸菌的活菌數為105～108cfu/g。

2.2 酵母菌和乳酸菌的初步分離和篩選結果

主要根據菌株的外形特征及生化特性對14個樣品中的微生物進行初步分離和篩選，分別挑選出菌落特征明顯且生長良好的酵母菌和乳酸菌單菌落分別為56個和67個。一般形態特征為細胞呈球形、卵圓形或橢圓形，單細胞，有核，無鞭毛；菌落呈圓形或橢圓形，凸起，表面光滑濕潤的為酵母菌。桿菌或球菌、革蘭氏陽性（紫）、過氧化氫酶陰性（無氣泡）的為乳酸菌。酵母菌和乳酸菌分別進行美蘭染色，革蘭氏染色后進行顯微鏡觀察的照片如圖1、圖2所示。

圖1 酵母菌

圖2 乳酸菌

傳統主食發酵劑屬于自然雜菌混合發酵，其主要優勢菌群為酵母菌和乳酸菌，酵母菌起發酵面團作用，乳酸菌酸化面團從而影響面團及終產品的特性。丁長河等［4］曾對傳統起子-酵頭中的微生物進行分析，根據碳水化合物的發酵和吸收從12個傳統酵頭樣品中分離出4種細菌和3種酵母菌，經生物梅里埃的Vitek-32系統自動鑒定，分離得到的3株酵母菌都為釀酒酵母，3株細菌分別為蠟樣芽孢桿菌、魯氏不動桿菌和短小芽孢桿菌。Hulya Gul等［5］從面包酸面團中篩選的酵母菌為Saccharomyces cerevisiae，S.delbrueckii，Torulopsis holmii and T.unisporus；乳酸菌有Lactobacillus divergens，Lactobacillus brevis，Lactobacillus amylophilus，Lactobacillus sake， Lactobacillus acetotolerans，Lactobacillus plantarum， Pediococcus pentosaceus，P.acidilactici和Tetragenococcus halophilus。

2.3 復篩

本研究的目的是從傳統的饅頭發酵劑中篩選性能優良的酵母菌和乳酸菌，并且適于純菌接種混合發酵生產具有特殊風味或特定功能饅頭的菌種。在面團發酵過程中酵母菌起發酵面團的作用，在混合發酵過程中，乳酸菌會產酸使面團的pH降低。所以對酵母菌主要根據其發酵性能、耐酸能力來進行復篩，經復篩挑選出15株，其編號及篩選結果如表1，尤其Sq4-3、Sq7-2、Sq9-2、Sq9-4、JZ1-4的性能較好。

表1 酵母菌的分離與篩選

表2 乳酸菌的分離與篩選

表3 菌種組合及評價結果

酵母菌和乳酸菌混合發酵過程中，若乳酸菌產酸能力太強，pH太低不僅會抑制酵母菌的生長，進而影響面團發酵性能，而且酸味過重影響產品風味，導致終產品不被消費者所接受。同時考慮到乳酸菌起影響風味的作用，所以乳酸菌復篩過程中主要根據其產酸產味特性篩出15株，其編號及篩選結果如表2。

2.4 混合發酵

篩選性能優良的酵母菌和乳酸菌是首要任務，但純菌接種混合發酵是今后研究的方向和重點。基于這一要求，挑選出一株優良的酵母菌和5株產酸能力不同的代表性乳酸菌進行饅頭混合發酵實驗，菌種組合及評價結果見表3。

由表3可以看出，添加乳酸菌的酸面團發酵的饅頭其感官總體評分要比只添加酵母菌的要高，而不同乳酸菌與酵母菌混合發酵對饅頭品質的影響也不同，添加乳酸菌Sq2.2的酸面團發酵的饅頭其總體感官評分最高為 7.56分，其次為 Sq3.1、Sq6.3和Sq4.5。

3 結論

根據菌株的外形特征及生化特性進行初步分離和篩選，再結合面團發酵過程中酵母菌和乳酸菌各自起的作用確定復篩標準經過復篩，其中酵母菌中Sq4-3、Sq7-2、Sq9-2、Sq9-4和JZ1-4的發酵性能較好。最后挑選酵母菌Sq4-3與5株代表性乳酸菌進行混合發酵實驗，發現不同乳酸菌與酵母菌混合發酵對饅頭品質的影響也不同，其中添加乳酸菌Sq2.2的酸面團發酵的饅頭總體感官評分最高為7.56分，其次為Sq3.1、Sq6.3和Sq4.5。

［1］楊敬雨，劉長虹.中國傳統酵子的工業化［J］.食品研究與開發，2007，28（2）：164-166.

［2］Rehman S，Paterson A，R.piggott J.Flavour in sourdough breads：a review［J］.Trends in Food Scienceamp;Technology，2006，（17）：557-566.

［3］蘇東海.饅頭酵母的分離與篩選［J］.農產品加工，2008（7）：82-84.

［4］丁長河，戚光冊，張建華，等.傳統起子（酵頭）的微生物分析及其對饅頭品質的影響［J］.食品科學，2007，28（4）：69-74.

［5］Gul H，Qzcelik S，Saodic O，et al.Sourdough bread production with lactobacilli and S.cerevisiae isolated from sourdoughs［J］. Process Biochemistry，2005，40：691-697.

［6］Haggman M，Salovaara H.Microbial re-inoculation reveals differences in the leavening power of Sourdough yeasts trains［J］. LWT，2008，41：14-154.

［7］Katina K，Heinio R.-L，Autio K，et al.Optimization of sourdough process for improved sensory profile and texture of wheat bread［J］.LWT，2006，39：1189-1202.

［8］Paramithiotis S，Chouliaras Y，Tsakalidou E，et al.Application of selected starter cultures for the production of wheat sourdough bread using a traditional three-stage procedure［J］.Process Biochemistry，2005，40：2813-2819.

［9］蘇東民.中國饅頭分類及主食饅頭品質評價研究［D］.北京：中國農業大學，2005.

Screening strains for co-fermenting Mantou

HU Li-hua1，SU Dong-min1，SU Dong-hai2，*，XIN Xiu-lan2
（1.College of Grain and Food，Henan University of Technology，Zhengzhou 450052，China；2.Biology Department，Beijing Vocational College of Electronic Science，Beijing 100029，China）

Traditional Mantou was fermented by natural mixed starter cultures with unique flavor.ln this study，the purpose is to screen lactic acid bacterias and yeasts from traditional starter cultures of Mantou，which have fine performance and are appropriate to co-ferment Mantou.The microorganisms of 15 LABs and 15 yeasts were obained from 14 samples through separating，screening and re-screening，especially the best strains were Sq4-3，Sq7-2，Sq9-2，Sq9-4 and JZ1-4 among yeasts.Eventually Sq4-3 and 5 representative strains among lactic acid bacterias were chosen to co-ferment Mantou.The results showed that different LAB had different effect on quality of Mantou.Mantou fermented by sourdough adding Sq2.2 have the highest score for the overall sense 7.56 points.

lactic acid bacteria；yeast；screen；Mantou

TS201.3

A

1002-0306（2010）11-203-04

2009-08-28 *通訊聯系人

胡麗花（1983-），女，碩士研究生，研究方向：傳統食品的工業化。

北京市自然科學基金資助項目（5093026）；北京市教委科技計劃面上項目（KM200900002003）。