甲氧芐啶對黃芩苷體外抗菌增效作用的試驗

王 新,崔一喆,韓鐵鎖

(黑龍江八一農墾大學動物科技學院,黑龍江大慶163319)

黃芩苷是從唇形科植物黃芩的干燥根中提取的一種黃酮類化合物,具有抗菌、消炎和免疫調節等多種藥理作用[1]。甲氧芐啶(TMP)為廣譜抗菌增效劑,臨床上常與磺胺類藥物聯用以增強磺胺類藥物的了抗菌效果,其還可增強多種抗生素以及中藥的抗菌作用[2-3]。而關于TMP對黃芩苷的抗菌增效作用未見報道。為了探討TMP對黃芩苷抗菌活性的影響,促進黃芩苷在防治畜禽傳染性疾病上的應用,進行黃芩苷與TMP聯用的性質和增效劑量關系的試驗,并確定TMP對黃芩苷體外抗菌增效的最佳劑量,為開發高效中藥復方抗菌制劑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種 沙門菌(CMCC50115)、大腸桿菌(ATCC35218)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)均購于中國獸醫藥品監察所。

1.2 藥物 TMP購于太原市康瑞寶獸藥制造有限公司,批號：20080503。黃芩苷購于四川什邡市宏升植物原料有限公司,批號：081102。

1.3 藥物溶液的制備 將128 mg的TMP制成濃度為1 280μg/mL的 TMP溶液100 mL。9.6 g黃芩苷用5%碳酸氫鈉溶液溶解后,再用蒸餾水稀釋成濃度為96 mg/mL的黃芩苷溶液100 mL,用孔徑為0.22μm的微孔濾膜濾過除菌后,4℃冰箱保存備用。

1.4 菌種活化 采用常規方法進行細菌活化,將菌液稀釋至濁度為 1×107CFU/mL,4℃冰箱保存備用。

1.5 黃芩苷與TMP聯合抑菌試驗 參照徐淑云報道[4]的微量棋盤稀釋法進行黃芩苷和TMP的聯合抑菌試驗,并進行組分抑菌濃度(FIC)指數的計算和判定藥物聯合作用的性質。

1.6 黃芩苷與TMP聯用體外抗菌增效試驗 用無菌肉湯將黃芩苷溶液稀釋到2MIC濃度,將TMP溶液稀釋到 640μg/mL、320 μg/mL、160 μg/mL、80μg/mL和40μg/mL濃度。取7只已編號無菌試管,1～5號管分別加入已稀釋的5種TMP溶液1 mL和2MIC的黃芩苷溶液1 mL,6號管中加入2MIC的黃芩苷溶液和肉湯各1 mL,7號管為對照管加入肉湯 2 mL;然后每個試管中加入 2×106CFU/mL細菌懸液0.1 mL。充分搖勻后,4℃條件下靜置。分別在1 h、2 h、4 h和8 h,采用平板計數的方法測定菌落數[5],并計算殺菌率。其計算公式為：殺菌率=(對照管菌落數-試驗管菌落數)/對照管菌落數×100%。試驗重復3次。

1.7 數據處理 采用SPSS軟件中ANOVA程序進行數據統計學分析。

2 結果

2.1 黃芩苷與TMP聯合抑菌試驗 由表1可知,黃芩苷與TMP聯用對3種細菌的MIC值均小于單獨應用,經計算對 3種細菌的 FIC指數均為0.75,呈現相加作用。

2.2 黃芩苷與TMP聯用體外抗菌增效試驗 試驗結果見表2、表3、表 4。從表中可知,當 TMP的添加劑量從20μg/mL-160μg/mL時,表現出隨著TMP劑量的增加對黃芩苷增效作用越強,與 TMP 0μg/mL組比較(P＜0.05或P＜0.01);但 TMP添加劑量為160μg/mL與320μg/mL兩組比較差異性不顯著(P＞0.05),表明TMP的添加劑量與對黃芩苷的增效作用并不是簡單的直線關系。利用最小二乘法對各表的1 h、2 h、4 h和8 h殺菌率數據進行擬合,擬合度均達到0.95以上,發現均符合一元二次方程y=ax2+bx+c;然后依據公式ymax=-b/2a計算各時間TMP添加的最優值。對于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門菌,TMP添加的最優值的平均值分別為 310μg/mL、276μg/mL和 233μg/mL;將TMP添加最優值的平均值與黃芩苷的實際用量進行換算,得到TMP對黃芩苷體外抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門菌最優添加劑量分別為103.3 mg/g、46.0 mg/g和38.8 mg/g。

表1 黃芩苷與TMP聯合應用的抗菌效果

表2 黃芩苷與不同濃度TMP聯合應用對金黃色葡萄球菌的殺菌率 (%)

表3 黃芩苷與不同濃度TMP聯合應用對大腸桿菌的殺菌率 (%)

表4 黃芩苷與不同濃度TMP聯合應用對沙門菌的殺菌率 (%)

3 討論

TMP對中藥增效作用的報道多是定性的研究[6-8],而TMP最佳添加劑量的研究更具有臨床應用價值。試驗采用了國內外常用的微量棋盤稀釋法測定了TMP與黃芩苷聯用的FIC指數,同時以黃芩苷和TMP的MIC值為基礎,設定了 TMP的系列添加劑量,然后將不同濃度的TMP與MIC濃度的黃芩苷聯合應用對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門菌進行體外抗菌量效關系試驗,采用了4℃靜置的方式使藥物作用于細菌,避免了37℃恒溫培養時細菌呈幾何基數增殖造成的用藥組與對照組之間的不可比性;再利用最小二乘法對試驗數據進行處理,從而提高了試驗結果的準確性。試驗結果表明,TMP對黃芩苷發揮顯著的增效作用。黃芩苷抗菌作用機制主要是通過抑制細菌的DNA、RNA、蛋白質的生物合成導致細菌細胞死亡而起到殺菌作用[9],這與TMP抑制細菌核酸合成的抗菌機制相近,可能是TMP對黃芩苷發揮抗菌增效作用的基礎,但具體機制有待于進一步探討。

[1] 文敏,李雪,付守廷.黃芩苷藥理作用研究新進展[J].沈陽藥科大學學報,2008,25(2)：158-162.

[2] 中國獸藥典委員會.中國獸藥典獸藥使用指南[S].北京：中國農業出版社,2005：76-77.

[3] 周可炎,曹迎春,譚超,等.TMP對中草藥煎液的抗菌增效作用[J].湖南農業大學學報,1999,25(6)：483-484.

[4] 徐淑云,卞如濂,陳修.藥理實驗方法學[M].3版.北京：人民衛生出版社,2001：1662-1663.

[5] 馬緒榮,蘇德模.藥品微生物學檢驗手冊[M].北京：科學出版社,2000：73-79.

[6] 常明向,高虹,吳梅梅.五味消毒飲與TMP聯用抗菌作用研究[J].中國藥理與臨床,2001,17(6)：10-11.

[7] 張文平,張文書,曾雪英.千里光與TMP聯用抗菌作用實驗研究[J].時珍國醫國藥,2006,17(6)：944-945.

[8] 馬卓,劉小平,何福艷,等.甲氧芐啶配用如意金黃散的抗菌實驗研究[J].湖北中醫雜志,2001,21(3)：5-6.

[9] 熊英,傅穎媛,況南珍,等.黃芩苷抗白念珠菌作用及機制研究[J].中國藥理學通報,2004,20(12)：1404-1407.