用RT-PCR方法檢測豬瘟細胞苗中污染牛病毒性腹瀉病毒

范學政,寧宜寶,王 琴,徐 璐,沈青春

(中國獸醫藥品監察所國家豬瘟參考實驗室,北京海淀100081)

牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)與豬瘟病毒(CSFV)均屬黃病毒科(F laviviridae)、瘟病毒屬(Pestivirus)成員。近幾年牛感染BVDV而持續帶毒現象時有發生。豬瘟細胞苗在生產過程中要用牛血清、胰酶、牛睪丸等材料,這些材料中若帶有低滴度的BVDV病原,會造成豬瘟細胞苗的污染。另外,用含BVDV抗體的牛血清也會干擾豬瘟病毒的體外培養[1]。更為嚴重的是,豬使用污染的豬瘟疫苗后可感染BVDV,出現類似于豬瘟的臨床癥狀和病理變化[2]。王新平等也從我國疑似豬瘟病料中檢出了 BVDV[3]。但BVDV株與CSFV株的核苷酸同源性約60%,氨基酸同源性約85%[4],在血清學上存在交叉反應[5],因而血清學方法難以區分,用常規的病原檢測方法難以對BVDV和CSFV進行鑒別檢測和診斷。目前,我國豬瘟活疫苗中BVDV污染情況時有發生,對疫苗質量帶來很大危害,為了調查BVDV在我國豬瘟活疫苗中的污染情況,建立特異敏感的 RTPCR方法對豬瘟細胞活疫苗進行檢測,保障豬瘟細胞活疫苗的質量勢在必行。

1 材料與方法

1.1 試驗用材料 BVDV O regon C24V株(cvcc AV 69,F5)、BVDV NADL 株(cvcc AV 67)及豬瘟兔化弱毒株(cvcc AV 1412)、BT細胞由中國獸醫藥品監察所菌種室提供,健康牛睪丸細胞為乾元浩北京生物制品廠張萬林博士惠贈;待檢豬瘟細胞苗為2008年從10個生物制品廠家抽檢的樣品,共計23個批次。

1.2 BVDV RT-PCR方法的建立

1.2.1 引物設計與合成 參考GenBank中BVDV O regon C24V(AF091605)和 HCLV(AF531433)序列,設計了一對能夠鑒別BVDV與HCLV的引物,擴增長度為470 bp,由上海英駿生物技術有限公司合成,用水稀釋至50 pm ol/μL。

1.2.2 RNA提取及合成cDNA 用T rizol裂解法提取BVDV Oregon C24V株RNA,按說明書進行,RNA模板用12μLDEPC水稀釋,然后按SSTⅢ反轉錄酶(Invitrogen)說明書進行反轉錄,獲得cDNA。

1.2.3 PCR反應體系的建立 對PCR反應的退火溫度、引物濃度及dNTP濃度等進行初步優化后確定反應體系。

1.2.4 RT-PCR特異性試驗 對BVDV Oregon C24V株、NADL株、Oregon C24V與 HCLV株混合樣品、HCLV株、牛睪丸細胞培養物等進行RTPCR并凝膠電泳,對470 bp大小的PCR產物進行測序鑒定。

1.3 豬瘟細胞苗中BVDV的檢測 用無菌水按1 mL/20頭份量將23個批次的疫苗分別稀釋,12 000 r/min離心30 min,取上清提取RNA,cDNA的合成和PCR過程按1.2進行,凝膠電泳檢測,對陽性樣本進行序列測定。

1.4 豬瘟細胞苗中 BVDV的序列比對 用DNAStar軟件包對序列進行比對,分析BVDV毒株的基因型。

1.5 豬瘟細胞苗中污染BVDV在BT細胞中的增殖 將檢測出BVDV污染的疫苗批次接種BT細胞,用含 5%FBS的 MEM 培養基在37℃、5%CO2條件下維持培養,觀察細胞生長情況。

2 結果

2.1 BVDV RT-PCR檢測方法的建立

2.1.1 RT-PCR反應條件 通過條件初步優化,確定反應體系為：上、下游引物工作濃度均為 0.6 pmol/μL,dNTP(each)濃度為 200 μmol;反應程序為：94℃3 min,94℃40 s,59℃40 s,72℃35 s,40個循環,72℃延伸10m in。

2.1.2 RT-PCR特異性試驗 用本文建立的RTPCR方法能檢測出Oregon C24V株和NADL株,擴增出470 bp大小的條帶,與理論值相符;而 HCLV株和牛睪丸細胞對照沒有擴增出條帶(圖1),將PCR產物測序后,與Oregon C24V株(AF091605)和NADL株(M 31182)進行比對,證明為BVDV Oregon C24V株和NADL株的特異序列。

圖1 不同樣本的PCR產物電泳結果

2.2 豬瘟細胞苗中污染BVDV的檢測 用建立的方法將23個批次的豬瘟細胞苗進行BVDV檢測,電泳后發現1、11、12、23、24號疫苗有陽性擴增(圖略)。BVDV污染率為5/23=21.74%。

2.3 豬瘟細胞苗中污染BVDV在BT細胞中的增殖 將BVDV陽性疫苗稀釋后離心取上清接種BT細胞,在培養5 d后細胞體積增大,邊緣不整齊,胞漿中出現典型小空泡CPE,呈葡萄狀排列。而健康細胞形態規則,邊緣整齊(圖2)。

2.4 豬瘟細胞苗中污染BVDV的序列比對 用DNAStar進行序列分析,證實污染的BVDV毒株全部為 BVDV I型,與 BVDV O regon C24V株(AF091605)的核苷酸相似性為83.2%～83.5%,與NADL株(M 31182)的核苷酸相似性為86.4%～86.7%(圖3)。

3 討論與小結

在我國控制豬瘟采取的是強制免疫措施,但豬場中經常發生一些不明原因的豬瘟免疫失敗現象,除了免疫程序、母源抗體干擾、豬瘟病毒持續感染等因素外,還可能與豬瘟疫苗污染BVDV而導致BVDV感染有關。Carbrey E A等觀察到母豬感染BVDV的癥狀為屢配不孕、產仔數下降和流產[6],經胎盤感染的仔豬可在出生后產生BVDV抗體,也有可能形成持續性感染,并且可將BVDV傳播給易感的母豬。但也有報道豬感染BVDV后產生的免疫反應能抵抗CSFV的傳播[7]。

目前豬瘟細胞苗生產中對BVDV病原的檢測方法主要有細胞培養、CSFV/BVDV/PPV三價熒光染色及其抑制試驗等,但這些方法在實際工作很難將CSFV和BVDV進行區分,不利于生物制品原材料的快速檢測。豬瘟原代細胞苗在生產過程中要用到牛血清、牛睪丸等牛源產品,原材料中若帶有低滴度的BVDV,就極易造成豬瘟細胞苗污染,荷蘭Wensvoort G等報道由于疫苗污染引起了8起豬的BVDV感染[1]。近幾年來豬瘟細胞苗質量不穩定,如滴度偏低,收次減少等,是否與細胞帶有低滴度的BVDV有關?為解決這些問題,有必要用更加敏感快速的方法來檢測BVDV。同時,使用傳代細胞替代原代細胞,用物理方法除去血清中污染的外源病原,可有效解決活疫苗中病原污染問題。寧宜寶等在這方面的研究已取得較大進展。中國獸醫藥品監察所和廣東永順聯合研制的豬瘟疫苗傳代細胞生產工藝已獲準田間試驗。

PCR方法作為一種分子診斷技術,具有常規診斷方法不可比擬的優點。近年來國內外也建立了一些檢測BVDV的PCR和核酸探針方法,對于牛源BVDV的診斷有良好的效果。但對于豬源BVDV和CSFV的鑒別診斷仍然不足。本研究通過對GenBank中BVDV毒株序列和CSFV毒株序列的綜合考慮,建立了一種特異性強、能夠區分HCLV和基因I型BVDV的PCR方法。通過對23批豬瘟細胞苗進行PCR檢測,發現有5批污染BVDV,污染率為21.74%。且全部為BVDV I型,與BVDV Oregon C24V株(AF091605)的核苷酸相似性為83.2%～83.5%,與NADL株(M 31182)的核苷酸相似性為86.4%～86.7%。這種污染是否會導致豬瘟疫苗免疫失敗、豬體感染及持續帶毒?值得行業者共同關注。

本研究中引物設計是針對BVDV-I型的,豬瘟疫苗中是否有BVDV-Ⅱ型污染尚不清楚。需用多種方法進行檢測才能全面了解豬瘟活疫苗的具體污染情況。通過本研究建立的PCR方法能區分BVDV和HCLV,可用于豬瘟細胞苗生產中的質控,以及豬群感染BVDV-I型情況的調查。

[1] Wensvoort G,Terpstra C.Bovine viral diar rhoea virus infections in piglets born to sow s vaccinated against sw ine fever with contam inated vaccine[J].Res Vet Sci,1988,45(2)：143-148.

[2] Terpstra C,W ensvoort G.Natural infections of pigs w ith bovine viral diarrhea virusassociated with signs resembling sw ine fever[J].Res Vet Sci,1988,45：137-142.

[3] 王新平,涂長春,李紅衛,等.從疑似豬瘟病料中檢出牛病毒性腹瀉病毒[J].中國獸醫學報,1996,16(4)：341-345.

[4] 謝西鋒,崔保安.牛病毒性腹瀉的研究概況[J].中國獸醫雜志,2001,37(11)：29.

[5] Thiel H J,Stark R,Weiland E,eta l.Hog cholera virus：m olecular composition of virions from pestivirus[J].JV irol,1991,65：4705-4712.

[6] Carbrey E A,Stew artW C,K resse J I,eta l.Natural infection of pigsw ith bovine viral diar rhea virus and its differential diagnosis from hog cholera[J].J Am Vet Med Assoc,1976,169(11)：1217-1219.

[7] Wieringa-Jelsma T,Quak S,Loeffen W L A.Lim ited BVDV transm ission and full protection against CSFV transm ission in pigs experim entally infected w ith BVDV type 1b[J].Vet M icrobiol,2006,118(1-2)：26-36.