雞源空腸彎曲菌和結腸彎曲菌的臨床分離及多重PCR鑒定

娜仁高娃,陳 霞,吳聰明

(中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京海淀100193)

彎曲菌(Campylobacter)尤其是空腸彎曲菌(C.jejuni)是重要的人畜共患病病原菌,在人可引起急性胃腸炎,感染嚴重者伴有心內膜炎、肺炎、敗血癥、血栓靜脈炎、腦膜炎、多發(fā)性關節(jié)炎以及格林-巴利綜合征等疾病[1-3]。家禽、家畜、寵物等動物是彎曲菌的常見宿主,因此研究動物源彎曲菌具有重要的公共衛(wèi)生意義。由于彎曲菌體外培養(yǎng)條件苛刻,需要專門的培養(yǎng)設備,而且生長周期較長,鑒定復雜,普通實驗室難以開展相關工作。本文在研究動物源彎曲菌過程中摸索出一套雞源空腸彎曲菌和結腸彎曲菌的分離培養(yǎng)及多重PCR鑒定方法,該方法操作簡便、快速,易于掌握,適用于基層實驗室分離鑒定彎曲菌。

1 材料與方法

1.1 質控菌株 空腸彎曲菌標準菌株ATCC 33560,金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC29213,均購于美國菌種保藏中心;大腸桿菌標準菌株ATCC25922,購于中國藥品生物制品檢定所,雞白痢沙門菌和雞傷寒沙門菌由本實驗室保存。

1.2 試劑及培養(yǎng)基 Skirrow氏彎曲菌選擇性培養(yǎng)基基礎及 Campy lobacter supplementⅢ(Skirrow),購自Sigma公司;布氏肉湯、哥倫比亞血瓊脂基礎及無菌脫纖綿羊血,購自北京陸橋技術有限責任公司;2X Taq PCR M asterM ix、低分子量 PCR M arker,購自天根生化科技(北京)有限公司;彎曲菌API鑒定條,購自Biomerieux公司。其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 樣本采集及菌株分離 用10 mL滅菌試管采集新鮮雞糞或盲腸內容物樣本3～5 g,低溫包裝運送至實驗室,用接菌環(huán)沾取少量(約0.1 g)劃線接種到Skirrow彎曲菌選擇性培養(yǎng)基上。將接種好的培養(yǎng)基置于二氧化碳培養(yǎng)箱內,微需氧條件下(5%O2、10%CO2、85%N2),42℃培養(yǎng) 48～ 72 h。選取不溶血半透明圓形菌落接種于哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基進行純培養(yǎng)。

1.4 菌株API鑒定 選取氧化酶結果陽性的菌株,用生理鹽水洗下哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上的純培養(yǎng)物制成6個麥氏濁度的菌懸液,按彎曲菌API鑒定條(API 20 800)使用說明書接種并培養(yǎng),判讀培養(yǎng)結果,查閱API 20 800鑒定標準進行菌株鑒定。

1.5 PCR引物設計 根據(jù)GenBank登錄的序列和Georgios Keramas[4-5]等報道的序列合成 3對PCR引物：針對彎曲菌屬16S rRNA基因的引物(16S-F和16S-R);針對空腸彎曲菌hipO基因的引物(HIP-F和 H IP-R);針對結腸彎曲菌 16S-23S rRNA基因的引物(CC-F和CC-R)。各對引物核苷酸序列及預期擴增片段長度見表1。引物由上海英駿生物技術有限公司合成。

表1 用于鑒別空腸彎曲菌和結腸彎曲菌的3對PCR引物序列、預期擴增片段長度

1.6 PCR鑒定 挑取哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基上的純培養(yǎng)物置于盛有800μL pH8.0 Tris-EDTA的離心管中,12 000 r/m in常溫離心1 m in,去上清。重復一次上述離心步驟后,用80μL Tris-EDTA重懸沉淀,放入100℃沸水中煮沸10 m in。取出置于冰浴中冷卻5m in后,12 000 r/m in(4℃)離心3 m in,取上清液作為PCR模板。PCR反應體系為20μL,其中2X Taq PCR M asterM ix 10μL,DNA模板1 μL,上下游引物(10 nmol/L)各0.5μL,滅菌超純水補足至20μL。PCR循環(huán)參數(shù)：94℃預變性10m in,94℃變性1 min,56℃退火40 s,72℃延伸 1 min,30個循環(huán)后 72℃再延伸 7 min。PCR產(chǎn)物以 DL-2 000作為DNA M arker,以1.2%瓊脂糖凝膠(含有0.5mg/L Goldview染料)、120 V電泳25m in,A lpha凝膠成像系統(tǒng)成像。PCR過程中以空腸彎曲菌ATCC33560作為陽性質控,以大腸桿菌ATCC25922作為陰性質控。

2 結果與分析

2.1 菌落形態(tài) 雞源的彎曲菌主要為空腸彎曲菌和結腸彎曲菌,兩者均為嗜熱微需氧菌,體外最適培養(yǎng)條件為 42℃,5%O2、10%CO2、85%N2。上述兩種彎曲菌在血瓊脂培養(yǎng)基上不溶血,初代分離的典型菌落形態(tài)為圓形,直徑 1～2 mm,隆起、中凸、光滑、閃光、邊緣整齊、半透明而中心顏色較暗,菌落呈淺灰色或黃褐色。

2.2 特異性試驗 采用本文建立的PCR方法,擴增空腸彎曲菌ATCC33560,在314 bp和149 bp處分別獲得預期的屬特異性條帶和種特異性條帶;擴增大腸桿菌ATCC25922未出現(xiàn)任何條帶(見圖1)。上述結果說明所建立的PCR法有較強的特異性。

圖1 彎曲菌多重PCR鑒定電泳結果

2.3 方法應用 應用建立的彎曲菌臨床分離及多重PCR鑒定方法,我們從774份新鮮雞糞樣品中分離出261株彎曲菌,其中208株空腸彎曲菌,53株結腸彎曲菌,總體分離率為33.7%。

2.4 PCR鑒定方法驗證 從PCR鑒定的彎曲菌中隨機挑取26株彎曲菌(其中空腸彎曲菌16株;結腸彎曲菌11株)進行API鑒定,鑒定結果與PCR結果一致。表明上述建立的彎曲菌多重PCR鑒定方法完全可在臨床菌株分離工作中應用。

3 討論

3.1 彎曲菌為苛養(yǎng)菌,營養(yǎng)要求高,體外培養(yǎng)需在培養(yǎng)基中加入一定量的全血或血清,通常含量為5%。此外,臨床分離彎曲菌時選擇性培養(yǎng)必不可少,加入一定量的抗生素增補劑(如多粘菌素B,1 250 IU;萬古霉素,5mg;三甲氧芐氨嘧啶,2.5mg)可抑制其他腸道菌的生長,以提高彎曲菌的分離率。

3.2 生化鑒定彎曲菌不僅操作繁瑣,而且結果不典型時,常需要傳代培養(yǎng)后再鑒定,檢測周期一般需要2～3周。法國生物梅里埃生產(chǎn)的API鑒定條一定程度上簡化了繁瑣的生化鑒定程序,但價格昂貴,使之難以成為一般實驗室的常規(guī)鑒定方法。本文建立的空腸彎曲菌和結腸彎曲菌多重PCR鑒定方法,不僅靈敏度高、特異性強,而且操作簡便快速、成本低廉,適用于基層實驗室開展雞源彎曲菌分離鑒定及其他相關研究工作。

3.3 H uo-Shu H等[6]應用ceuE基因建立了檢測空腸、結腸彎曲菌的多重PCR方法,可分別擴增出了645 bp和783 bp的特異性片段,但部分腸道菌可擴增出小于645 bp的非特異性片段。何蕊等[7]以 mapA基因建立了檢測空腸彎曲菌的PCR方法,但mapA基因的特異性不強,而且并非所有的空腸彎曲菌都能夠擴增出589 bp的特異性片段。本文建立的多重PCR法不僅能擴增出彎曲菌屬的特異性片段,而且能分別擴增出空腸、結腸彎曲菌各自的特異性片段,因此具有較強的特異性。尤其是本方法PCR擴增的馬脲酸酶基因(hipO)為空腸彎曲菌(包括空腸亞種和德萊亞種)所特有[8],因此能有效區(qū)分空腸彎曲菌和結腸彎曲菌。

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