馬皰疹病毒gD蛋白主要抗原域的表達及初步應用

時成龍,侯玉杰,相文華,郭 巍,李紅梅,趙立平,何劍斌

(1.沈陽農業大學畜牧獸醫學院,遼寧沈陽110161;2.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所,黑龍江哈爾濱150001)

馬皰疹病毒 1型和4型是馬鼻肺炎的病原,EHV-1主要導致妊娠馬流產,還可引起呼吸道癥狀、馬駒死亡和神經癥狀;EHV-4主要導致呼吸道癥狀,偶爾可引起流產。該病在全世界廣泛分布,并對所有年齡和種類的馬以及其他馬屬動物的健康構成嚴重威脅。1980年我國殷震、劉景華等人從東北兩個馬場的流產胎兒首次分離到馬鼻肺炎病毒[1]。目前國際上檢測該病的方法有很多,但國內對ELISA檢測EHV抗體的報道很少[2-3],關于EHV分子生物學的研究也不多。本研究克隆EHV-1/4 gD基因同源性高且抗原性強的C端序列,并進行原核表達及純化,對重組pET-gD蛋白進行免疫原性鑒定,為馬鼻肺炎的檢測工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 馬皰疹病毒1型438/77株、馬皰疹病毒4型405/76株、馬胎皮膚細胞、EHV-1/4高免兔血清、DH5α、BL21及 pET-30a均由中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所馬病研究中心保存。MEM及胎牛血清購自Gibco。H is-Tag M onoclonal Antibody、Anti-M ouse IgG、A nti-Rabbit IgG、A ntihorse IgG購自Sigma公司。

1.2 引物設計 根據GenBank上的EHV-1/4基因序列,應用DNAStar軟件分析gD蛋白的抗原性及同源性,設計一對抗原性強且同源性較高的引物。GF ：5′-GGA TCCATGCGGATTGTTACT -3′(Bam H Ⅰ);GR ：5′-GGTCGACTTACGGGTCTGTTT-3′(SalⅠ)

1.3 病毒增殖 將EHV-1接種長成單層的馬胎皮膚細胞上,吸附40min后加入含4%血清的維持液,置于37℃,5%CO2條件下培養。出現80%以上細胞病變時收毒,-70℃保存。

1.4 EHV-1 gD基因主要抗原區編碼基因的擴增取250μL病毒,按Omega公司試劑盒操作說明提取病毒DNA,-20℃保存。取5μL EHV-1 DNA作為PCR模板進行擴增,退火溫度54℃,時間40 s,30個循環。PCR產物進行瓊脂凝膠電泳鑒定并經膠回收試劑盒回收。

1.5 表達載體pET-gD的構建 將PCR膠回收產物與pET-30a質粒分別用Bam HⅠ和Sa lⅠ雙酶切并回收目的片段,T4 DNA連接酶16℃過夜連接,轉化至DH 5α,37℃培養12 h后,從 LB平板(50 μg/mL Kan)上挑單菌落,接種于 LB培養基(50 μg/mL Kan),37℃震蕩培養 12 h,保存菌種,提取質粒用Bam HⅠ和SalⅠ雙酶切鑒定,將鑒定結果為陽性的菌種送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。選取測序結果與目的片段序列相一致的陽性質粒并命名為pET-gD,并將陽性質粒轉化至表達感受態BL21(DE3)。

1.6 陽性轉化菌的誘導表達和表達產物的免疫印跡試驗(Western blot)鑒定 將陽性轉化菌接種于含LB培養基(50μg/mL Kan)中37℃震蕩過夜培養。次日以1%量接種于5mL LB培養基(50μg/mL Kan)中37℃震蕩培養至OD600約為0.6時分別加入 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 mmo l/L 的 IPTG 進行誘導培養,在誘導2 h、4 h、6 h、8 h和過夜分別取樣進行SDS-PAGE分析。

超聲波處理后經SDS-PAGE并轉膜,4℃封閉過夜,次日分別加入首抗His-Tag M onoclonal Antibody,二抗 Anti-Mouse IgG。用 Western blot超敏發光液顯色。

1.7 蛋白表達形式鑒定及蛋白純化 將陽性轉化菌接種于50mL LB培養基(50μg/mL Kan)中培養,OD值約為0.6時開始誘導表達,4 h后收獲菌體細胞,用5mL 1×PBS重懸,超聲波處理細胞重懸液至清亮,4 000 r/min(4℃)離心10min,分別收獲沉淀和上清液,經SDS-PAGE檢測表達蛋白的存在形式。

切下目的條帶并研磨[4],浸于1 mL蛋白浸出液中4℃過夜,次日回收液體,SDS-PAGE鑒定并用BCA方法測定蛋白含量。

1.8 重組蛋白抗原性的鑒定 分別用本實驗室已制備的兔抗EHV-1/4高免血清為首抗,Anti-Rabbit IgG為二抗,Western blot以鑒定純化蛋白的反應原性。

1.9 間接ELISA檢測 使用純化后的重組pET-gD蛋白1μg/mL濃度包被,4℃過夜。次日洗滌后用含5%脫脂乳的PBS 37℃封閉2h,將待檢馬血清按1∶100稀釋,每個樣品做3個平行樣,37℃作用1 h,洗滌后將Anti-horse IgG 1∶10 000稀釋加入并37℃作用1 h。再洗滌加入含0.4 mg/mL OPD的底物緩沖液,避光顯色15 min,加入H2SO4終止反應,用酶標儀492 nm波長測定OD值。

1.10 臨床樣品檢測 利用本試驗初步建立的馬鼻肺炎間接ELISA方法對全國不同地區的383份馬血清樣本進行檢測。初步調查了全國部分地區馬鼻肺炎的感染情況。

2 結果

2.1 目的基因的擴增及重組質粒的鑒定 提取EHV-1病毒總DNA,應用設計的引物PCR擴增出大小為685 bp的片段。

挑取表達載體轉化菌落,振蕩培養后提取質粒,應用Bam HⅠ和Sa lⅠ酶切鑒定。結果表明目的片段已經插入pET-30a載體中。

2.2 陽性轉化菌的表達優化及純化 不同時間和不同濃度IPTG誘導表達產物的SDS-PAGE結果表明,時間從2 h到過夜和IPTG濃度從0.2～1.0 mmol/L均可有效誘導目的蛋白,但以 IPTG0.8 mmol/L誘導4h的效果最佳(圖1、圖2)。表達產物的大小約為35 kDa,與預期蛋白分子量一致,占總菌體蛋白含量約為55%。在最佳條件下進行大量誘導,超聲破碎后收集上清及沉淀,SDS-PAGE表明重組蛋白為包涵體形式,并進行切膠純化(圖3)。

圖1 0.8 mmol/L ITPG濃度時不同時間誘導蛋白表達

2.3 表達產物的Western blot檢測 純化后的pET-gD融合蛋白分別與兔抗EHV-1/4陽性血清反應后,均在35 kDa處出現特異性條帶(圖 4),Western blot結果表明,純化后的該蛋白具有反應原性。

2.4 表達產物的間接ELISA檢測 間接ELISA檢測結果顯示,重組的pET-gD蛋白能到與EHV馬陽性血清發生反應,而不與健康馬血清、EAV馬陽性血清、JEV馬陽性血清、EIV馬陽性血清發生反應(圖5)。

2.5 全國各地區馬鼻肺炎的檢測 應用本試驗表達的蛋白初步建立的間接ELISA診斷方法對全國部分地區的馬鼻肺炎樣品進行檢測,結果表明,383份馬血清樣本中83份血清的馬鼻肺炎抗體呈陽性,血清陽性率為21.67%(見表1)。

圖5 間接ELISA分析純化的重組pET-gD蛋白

表1 全國部分地區馬鼻肺炎的感染情況

3 討論

EHV-1/4大多數糖蛋白鑲嵌在病毒囊膜上,作為纖突蛋白突出于病毒粒子表面。是誘發體液免疫反應和細胞免疫反應的主要病毒蛋白[5],其中5個糖蛋白(gB、C、D、H 、L)上含有重要的病毒中和表位,在感染馬內產生針對EHV-1/4的抗病毒血清學反應,而gD誘導的保護反應最為強烈[5-6]。本試驗選取目的片段為EHV-1/4 gD基因主要抗原區域C端序列,而且具有非常高的同源性。構建的陽性克隆pET-gD表達產物用Western blot進行抗原性分析,兔抗 EHV-1、EHV-4高免血清均能與EHV-1 gD基因表達的產物反應,結果表明,EHV-1 gD基因C端的原核表達產物具有EHV-1、EHV-4型共同抗原。說明了 EHV-1 gD原核表達產物可作為ELISA包被抗原。利用重組pET-gD蛋白建立的ELISA與病毒中和試驗具有非常高的符合率[2]。Doll E R和Bryans JT(1962)等認為病毒中和抗體可維持6～12個月甚至更長時間,因此應用EHVgD-ELISA可檢出較高的陽性率[7]。

2010年,在我國舉行亞運會,農業部對賽馬引進及本地馬匹血清學檢測工作非常重視。目前,國際上已有重組蛋白建立的間接和單抗阻斷ELISA技術,用來檢測和區分EHV-1和EHV-4血清型的產品[7-9],但進口試劑盒價格過于昂貴,所以我國自主研發檢測方法也正在進行中。本試驗為我們進一步開發擁有自主知識產權的能檢測和區分EHV-1/4的ELISA試劑盒提供了充分的基礎[9-10]。

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[3] 時成龍,侯玉杰,相文華,等.馬鼻肺炎病毒主要糖蛋白及其功能[J].動物醫學進展,2009,30(12)：1-3.

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