棕櫚酸對胰島β細胞激素敏感性脂肪酶的影響

王詠波 陳璐璐 田源 李燕

棕櫚酸對胰島β細胞激素敏感性脂肪酶的影響

王詠波 陳璐璐 田源 李燕

長期的高脂會造成胰島β細胞胰島素分泌障礙和三酰甘油(TG)的堆積，而過度堆積的TG是脂毒性的重要表現。

激素敏感性脂肪酶(HSL)是催化TG水解的限速酶，在胰島β細胞內表達和活化，并可能與胰島素分泌及β細胞TG堆積有關。但是高脂對HSL的影響并不十分清楚。因此，本實驗以不同濃度棕櫚酸培養胰島β細胞，觀察其HSL的變化。

一、材料和方法

1．細胞培養：NIT-1細胞株(來源于轉基因小鼠的胰島β細胞系)購于華中科技大學同濟醫學院免疫學系，常規培養傳代。取對數生長期的NIT-1細胞，按1.0 ×106個/ml接種于6孔培養板中培養24 h,換含不同濃度棕櫚酸(0、0.125、0.25、0.5 mmol/L)的2%胎牛血清的DMEM培養液繼續培養24、48和72 h。每種濃度、每個時間點均設3個復孔。

2．胰島細胞TG含量測定：細胞用預冷的PBS洗滌、離心后置氯仿/甲醇 (2∶1 vol/vol)4℃過夜，3000 r/min離心15 min，棄上清后干燥，再溶于異丙醇,測定TG 含量。

3．HSL活性測定：將細胞分別加入含或不含10-5mol/L的異丙腎上腺素的PBS液中，置37℃溫浴1 h，3000 r/min離心15 min，取上清測定甘油的含量，它代表HSL的活性。甘油的測定按照試劑盒(Rochester公司)說明書操作。

4. HSL mRNA檢測：采用RT-PCR方法。用Trizol試劑(Invitrogen 公司)提取細胞總RNA。HSL引物上游5′-GGCTGGAACCAACCCTAG-3′,下游5′-AGTCCTTCATCACCCTCGA-3′，擴增產物306 bp；內參β-actin引物上游5′-CTGGCACCACACCTTCTACA-3′，下游5′-AGTACTTGCGCTCAGGAGGA-3′，擴增產物758 bp，由上海博亞基因技術有限公司合成。cDNA合成反應為42℃ 1 h；PCR反應：94℃ 5 min，94℃ 60 s、50℃ 90 s、72℃ 60 s,36個循環，最后72℃延伸5 min。擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳后掃描分析。

5．HSL蛋白檢測：采用Western blotting方法。收集培養的各組細胞,加入裂解緩沖液裂解細胞, 4℃離心,取上清，測蛋白濃度。取50 μg蛋白質行Western blotting。用Labworks圖像分析系統掃描,以光密度值計算蛋白表達量。

二、結果

1．棕櫚酸對NIT-1細胞內TG含量的影響：0、0.125、0.25和0.5 mmol/L棕櫚酸干預24 h后，TG含量分別為(3.25±0.42)pmol/106cell、(3.74±0.44)pmol/106cell、(4.35±0.58)pmol/106cell和(5.76±0.51)pmol/106cell；48 h后為(3.52±0.37)pmol/106cell、(4.03±0.55)pmol/106cell、(5.11±0.59)pmol/106cell和(6.54±0.47)pmol/106cell。

0.125 mmol/L組干預后48 h以及0.25 mmol/L和0.5 mmol/L組干預后24 h均較不加棕櫚酸組明顯增加(P<0.05)。

2．棕櫚酸對NIT-1細胞HSL mRNA和蛋白表達的影響：干預24 h時NIT-1細胞內HSL mRNA和蛋白的表達隨著棕櫚酸濃度的增加而逐漸增加；干預48 h時0.25 mmol/L組HSL mRNA和蛋白的表達量最高(圖1、2)。

圖1 棕櫚酸干預NIT-1細胞24(a)、48 h(b)時HSL mRNA的表達

圖2棕櫚酸干預NIT-1細胞24(a)、48 h(b)細胞HSL蛋白表達

討論游離脂肪酸(FFA)作為胰島素分泌的信號分子，短時間內(<3～6 h)升高可促進基礎和葡萄糖刺激后胰島素分泌(GSIS)[1-2]，而長時間(>24 h)的高FFA則產生脂毒性，抑制GSIS，引起β細胞凋亡[3-6]。這主要是由飽和脂肪酸引起[7]。因此本實驗采用體外棕櫚酸(飽和脂肪酸)干預來研究高脂對胰島細胞的HSL及脂質的影響。

Winzell等[8]報道，高脂喂養的小鼠，血漿FFA升高，胰島TG堆積，胰島素分泌障礙， HSL表達先升高后下降，說明了高脂對HSL的早期調節，也證實了脂毒性的存在。胰島HSL表達的下調可能是機體為減少TG水解，減少脂肪酸的產生，減輕脂毒性，對脂肪酸介導的胰島細胞功能障礙作出的自身保護性反應。Winzell等[9]采用HSL過表達轉基因鼠來研究HSL與胰島β細胞脂毒性的關系。與野生鼠相比，HSL過表達鼠在接受高脂飲食后，表現出胰島細胞中TG含量減少，葡萄糖耐量異常，GSIS障礙。推測HSL過表達鼠在長期高脂飲食下不能適當地調節HSL，HSL持續刺激細胞內TG分解，加重了脂毒性。本實驗結果顯示，隨著棕櫚酸濃度增加和干預時間的延長，細胞內TG含量也呈現出增加趨勢。同時，HSL mRNA 和蛋白的表達也增加，與Winzell等[8]的結果相似。

文獻報道[10-11]，FFA促進HSL表達的同時卻抑制了HSL的活性。本結果顯示棕櫚酸的干預對HSL活性并無影響。Hu等[12]認為，在相同條件下，FFA對脂肪組織脂解表現為抑制，而對胰島細胞表現為促進。但他們強調了LC-CoA在胰島素分泌中的重要作用，而忽略了細胞內長期高LC-CoA對胰島細胞的毒性作用。本實驗脂解沒有明顯增加可能正是長期高LC-CoA對胰島細胞的毒性作用的表現，只是FFA對胰島細胞脂解的抑制作用出現得更緩慢一些。

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10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.01.021

湖北省自然基金(2003AA143)

430022，武漢，華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院內分泌科(王詠波現在大連醫科大學附屬第一醫院內分泌科)

陳璐璐，Email:cheria_chen@sohu.com

2009-04-02)