鹽酸左氧氟沙星在大鼠胰腺的藥代動力學研究

劉德鼎 肖和平 王卓 周佳 宋彬 楊琳 劉瑞 黃怡

·論著·

鹽酸左氧氟沙星在大鼠胰腺的藥代動力學研究

劉德鼎 肖和平 王卓 周佳 宋彬 楊琳 劉瑞 黃怡

目的研究鹽酸左氧氟沙星在大鼠胰腺組織的藥代動力學。方法采用微透析技術對大鼠胰腺組織和血液進行同步取樣，聯合反相高效液相色譜實時檢測胰腺組織和血液中鹽酸左氧氟沙星的濃度變化，所得藥物濃度數據用WinNonlin軟件處理。結果大鼠血液中的游離左氧氟沙星濃度在給藥后10 min時最高，為(65.23±12.9) μg/ml，胰腺組織在20 min到達峰濃度(30.56±3.22) μg/ml，然后持續下降；給藥后20 min時胰腺組織的藥物濃度開始高于血清，并持續至100 min,然后下降，兩者濃度始終保持接近。血液、胰腺的藥時曲線下面積分別為(2914.38±205.73)min·μg-1·ml-1和(2465.11±258.56)min·μg-1·ml-1。結論微透析采樣技術聯合反相高效液相色譜檢測方法可以準確客觀地反映藥物在組織和血液中的藥代動力學特點，鹽酸左氧氟沙星具有較高的胰腺組織藥物濃度。

左氧氟沙星； 微透析； 藥代動力學； 藥效學； 高效液相色譜法

胰腺感染是重癥急性胰腺炎(SAP)患者病死的主要原因，約占80%。鹽酸左氧氟沙星是新一代氟喹諾酮類抗菌藥，系氧氟沙星的光學S-(-)異構體，其作用機制為抑制細菌拓撲異構酶Ⅱ的活性，抑制細菌DNA復制而起到殺菌作用。它具有較好的臨床藥動學特性、較佳的組織臟器及細胞滲透性，對大多數腸桿菌科細菌有較強的抗菌活性[1]，在急性胰腺炎(AP)并發感染時臨床醫師常經驗性選用此藥[2]。復習文獻，僅有環丙沙星、氟康唑、厄他培南和莫西沙星在胰腺的藥代動力學報道[3-6]，故本實驗同步測定鹽酸左氧氟沙星在大鼠胰腺和血液中的濃度，觀察其在胰腺組織的藥代動力學特點。

材料與方法

一、實驗動物和儀器、試劑

SD大鼠6只，SPF級，體重220～250 g，雄性，第二軍醫大學動物中心提供。微透析設備為瑞典CMA公司產品，包括微量泵(CMA402)、微量收集器(CMA820)、1 ml注射器、血管及胰腺探針(CMA/20 PES)。探針內透析膜長度10 mm，直徑0.5 mm，截留分子量100 000。LC-2010AHT高效液相色譜儀為日本島津公司產品，Kromasil C-18柱150 mm×4.6 mm,5μm。流動相由0.4%磷酸/三乙胺(pH 3.58)與甲醇(v/v)以70∶30組成，流速1.0 ml/min，柱溫40℃，檢測波長295 nm，進樣量10 μl。

試劑包括鹽酸左氧氟沙星標準品，鹽酸左氧氟沙星原料藥(武漢合中生化制造有限公司,純度99%,批號20090901)，戊巴比妥鈉(Sigma公司,純度≥98%,批號P3761)，ACD液(枸櫞酸鈉22 mg/ml，枸櫞酸8 mg/ml，葡萄糖24.5 mg/ml,上海輸血技術有限公司,批號09081621B)，甲醇(TEDIA,色譜純)，超純水，以及分析純級的三乙胺和磷酸。

二、探針回收率測定

采用反向透析法。大鼠麻醉后固定于37℃保溫墊，取腹正中切口進腹，循血管間隙將微透析探針植入胰腺實質，并固定關腹。采用經左側股靜脈途徑將血管探針植入下腔靜脈[7]。探針植入成功后，胰腺探針灌注Ringer液；血管探針灌注ACD抗凝液，以防止探針透析膜部發生凝血[8]。經過術后2 h穩定期，更換各含鹽酸左氧氟沙星(中國藥品生物制品檢定所，純度99.8%)1 μg/ml的Ringer和ACD液，以2 μl/min的恒定速率分別對胰腺、血管進行灌流。灌注液(Cperf)和透析液(Cdial)中的藥物濃度均用HPLC測定。探針的在體回收率(Rdial)用下列公式計算：Rdial=(Cperf-Cdial)/Cperf。體內實際藥物濃度(Cu)可由體內連續監測所得透析液濃度(Cm)經公式Cu=Cm/Rdial轉化獲得。

三、藥代動力學分析

鹽酸左氧氟沙星模擬人體常用給藥劑量(400 mg/d)，大鼠給藥量為42 mg/kg體重[9]。經大鼠尾靜脈15 min內推注完畢，隨即開始收集透析樣品，前240 min每間隔10 min收集一次樣品，以后每20 min收集一次樣品，至360 min時結束，同步監測給藥后360 min內的大鼠血液及胰腺藥物濃度變化。

使用Phoenix WinNonlin(Pharsight Corporation,Version 6.1,2009)軟件以非房室模型法獲得藥動學數據。根據測量值計算曲線下面積(AUC)，AUC=AUC(0-t)+AUC(t-inf)=AUC(0-t)+Clast/λz ；一階矩曲線下面積(AUMC)，AUMC=AUM Clast+(tlast×Clast/λz )+Clast/(λz )2；平均駐留時間(MRT)，MRT=AUMC/AUC。其中λz 為對數藥物濃度-時間曲線尾段指數段的斜率，Clast和tlast為最后(360 min時)的濃度和時間。血液與胰腺的藥物分布系數用AUC胰腺/AUC血液計算，鹽酸左氧氟沙星對血胰屏障的通透率(penetration ratio,PR)用C胰腺/C血液計算。

結 果

一、鹽酸左氧氟沙星的色譜條件考查

在本實驗條件下，透析液中無內源性干擾物質，左氧氟沙星峰形良好，分離度良好，保留時間為3.58 min。

準確稱取鹽酸左氧氟沙星標準品，加超純水配成系列溶液，平行操作3份，取10 μl進樣，HPLC測定并記錄峰面積，其最低定量限為0.0304 μg/ml。以左氧氟沙星峰面積(Y)對濃度(X)進行線性回歸，所得標準曲線為：Y=54680.4X-12610.8(r2=0.9998)，表明透析液中左氧氟沙星在0.0304～125 μg/ml的濃度范圍內線性良好。

取左氧氟沙星低、中、高3個濃度的標準品溶液，在1 d內連續測定6次，日內精密度(RSD)分別為0.62%、6.45%、3.18%；連續3 d測定，各濃度的日間精密度分別為0.87%、6.28%、5.55%。精密度和準確度均符合生物樣品測定要求。

二、鹽酸左氧氟沙星的藥代動力學

6只大鼠血液和胰腺探針的平均回收率分別為(58±2)%和(34±1)%。1只大鼠胰腺探針的回收率較低，僅為27%,其余的回收率在34%～37%。樣品收集完成后，所有實驗動物行剖腹探查，未發現胰腺出血及異常液體積聚。后將探針留置于胰腺內行石蠟切片，證實探針植入部位為胰腺實質。

非房室模型參數詳見表1。血液中鹽酸左氧氟沙星濃度在給藥后10 min時最高，Cmax為(65.23±12.9) μg/ml，個體最高值為104.76 μg/ml；胰腺中藥物在20 min時達峰值，Cmax為(30.56±3.22) μg/ml，然后持續下降。20 min時胰腺組織的藥物濃度開始高于血清，并持續至100 min，期間9個取樣點的血胰屏障通透率(PR)=1.09±0.1，最高為1.27；從110 min起胰腺藥物濃度低于血清，直至取樣結束，期間20個取樣點的PR=0.87±0.05，最低值為0.79。血液、胰腺的藥時曲線下面積AUC(0-inf)分別為(2914.38±205.73)min·μg-1·ml-1和(2465.11±258.56)min·μg-1·ml-1。其中外推法估算的AUC(t-inf)占AUC(0-inf)的比值在血液為(8.86±0.03)%，胰腺為(9.52±0.04)%。血液與胰腺的藥物分布系數為0.85±0.35。尾靜脈推注鹽酸左氧氟沙星后各時間點胰腺、血清中藥物濃度對數圖見圖1，藥物對血胰屏障通透率-時間曲線見圖2。

參 數血 液胰 腺t1/2(min)125.23±43.33136.73±44.77Cmax(μg/ml)65.23±12.930.56±3.22tmax(min) 1020AUC0-inf(min·μg-1·ml-1)2914.38±205.732465.11±258.56AUC0-t(min·μg-1·ml-1)2645.07±179.652213.14±221.67MRT(min)132.87±31.5147.01±38.24

注：Cmax和tmax分別為藥物在組織中的峰濃度和到達峰濃度時間；AUC0-inf、AUC0-t分別表示曲線下總面積和截止至終末觀察點時的曲線下面積；MRT為藥物分子在體內的平均駐留時間

討 論

以往使用的胰腺藥代動力學研究方法，包括胰腺組織勻漿法、胰瘺管和內鏡導管法均有較大缺陷，所獲數據不能準確反映胰腺組織間液游離態藥物代謝情況[10]。近來雖有一些非侵襲性手段，如PET(positron emission topography)和NMR(nuclear magnetic resonance)的出現并應用于胰腺藥代動力學研究[11]，但其科研成本極高，且依然無法對細胞內與組織間液進行精確定位。微透析是日漸興起的一種新型生物采樣技術，主要利用物質沿濃度梯度擴散和半透膜對小分子化合物具有通透性的原理，對細胞外液(ECF)的物質進行采樣，可將胰腺和血漿中蛋白結合態藥物截留于探針透析膜外，所測樣品為游離態藥物濃度，結合探針透析率，可計算出同一個體靶組織細胞外液密集時間點的對應藥物濃度，具有良好的時間和空間分辨性，是進行藥動學研究的良好工具。

血液微透析技術多采用經頸靜脈向右心房插管法植入探針。本實驗采用經左側股靜脈植入下腔靜脈，回收率平均為58%，最高達65%，高于頸靜脈探針植入法所獲得的回收率[12]，且回收率較穩定，個體間差異小。這是因為：(1)下腔靜脈的血液流動快，可避免血流速度慢對探針回收產生的影響，更真實地反映血藥濃度；(2)能夠避免對重要臟器血供的干擾；(3)下腔靜脈具備理想的直行長度，允許透析部較長的探針充分發揮透析功能，提高探針回收率。

圖1 10～360 min內各采樣點的血液和胰腺濃度對數圖

圖2各采樣點的鹽酸左氧氟沙星對大鼠血胰屏障通透率(PR)

在胰腺微透析采樣中，動物個體差異對探針回收率造成的影響并不顯著。因為本實驗所使用的探針為商品化CMA探針，探針物理性質穩定，胰腺微透析所選取的部位較為固定，均為胃底靠近脾臟部，探針植入點周圍主干血管及毛細血管解剖分布基本相同，故微循環對藥物的轉運在不同個體間相似，所測探針回收率在個體間差異較小。

鹽酸左氧氟沙星的AUC0-inf呈劑量依賴性[13]，本實驗大鼠所用藥物劑量相當于人體給藥400 mg/d，血液到胰腺的藥物分布系數為0.85±0.35，表明鹽酸左氧氟沙星具有較高的胰腺組織穿透力，這與血胰屏障多脂類成分的結構及左氧氟沙星脂溶性強的特點有關。分析藥物在胰腺組織的分布過程，靜脈給藥后20 min，胰腺組織的藥物濃度開始高于血清，并持續至100 min， PR=1.09±0.1，提示血胰屏障中可能存在藥物轉運體。胰腺的左氧氟沙星分布是由被動轉運與主動轉運共同調控，Ito等[14]曾在腎臟中發現左氧氟沙星的主動轉運系。藥物在胰腺組織的清除率及平均駐留時間與血液基本一致，表明兩者代謝消除過程基本相似。從110 min至取樣結束，胰腺藥物濃度低于血清，PR=0.87±0.05，無明顯差異，可能與藥物的轉運清除在兩個方向達到飽和有關。本實驗的PR數據均低于馬珂等[15]的報道，而血漿中的藥物半衰期無明顯差異。我們認為，除大鼠個體差異影響，本文采用微透析技術所測對象為組織間液游離態藥物濃度，不包括蛋白結合態藥物及細胞內藥物，因此可能低于組織勻漿法所獲的數據。

對于胰腺抗感染治療，病原學是抗菌藥物選擇的重要依據。不同病因引發胰腺感染的病原學特點并不相同，如非手術治療中革蘭陰性桿菌是胰腺感染的主要病原體，包括大腸桿菌、克雷伯菌屬及厭氧菌等，而膽源性胰腺炎合并膽道梗阻的患者，銅綠假單胞菌、厭氧類桿菌、腸球菌等為主要致病菌。張菁等[16]報道，左氧氟沙星對溶血性鏈球菌、卡他莫拉菌具有高度抗菌活性，但甲氧西林耐藥金葡菌(MRSA)、大腸埃希菌、鮑曼不動桿菌及大多數腸球菌對左氧氟沙星呈現耐藥。一般認為氟喹諾酮類藥物的Cmax/MIC達8～10時，可獲得良好的臨床和細菌學療效，并可減少細菌對該類藥物耐藥性的產生，但治療嚴重革蘭陰性桿菌感染，AUC0-24 h/MIC90應為100～125。故在胰腺抗感染治療中，雖然鹽酸左氧氟沙星具有較高的胰腺組織穿透力，但并非對所有菌群都能產生良好的抗菌作用，提高給藥劑量是增強療效、減少細菌耐藥的方法，但仍需分辨病因，依據病原學特點有針對性的選擇抗感染藥物。

[1] 梁錦芬,江秀麗,蔡萍,等.左氧氟沙星的臨床應用及不良反應.中華臨床醫學研究雜志,2006,12:634-635.

[2] 葉華進,吳小彤.急性胰腺炎治療中抗菌藥物使用分析.醫學研究雜志,2008,37:90-92.

[3] Büchler M,Malfertheiner P,Frieb H,et al. Human pancreatic tissue concentration of bactericidal antibiotics. Gastroenterology,1992,103:1902-1908.

[4] Bassi C,Pederzoli P,Vesentini S,et al. Behavior of antibiotics during human necrotizing pancreatitis.Antimicrob Agents Chemother,1994,38:830-836.

[5] Wittau M,Wagner E,Kaever V,et al.Intraabdominal tissue concentration of ertapenem.J Antimicrob Chemother,2006,57:312-316.

[6] Wacke R,F?rster S,Adam U,et al.Penetration of moxifloxacin into the human pancreas following a single intravenous or oral dose.J Antimicrob Chemother,2006,58:994-999.

[7] Evrard PA,Deridder G,Verbeeck RK.Intravenous microdialysis in the mouse and the rat:development and pharmacokinetic application of a new probe.Pharm Res,1996,13:12-17.

[8] Wu JW,Tsai TH.Effect of silibinin on the pharmacokinetics of pyrazinamide and pyrazinoic acid in rats.Drug Metab Dispos,2007,35:1603-1610.

[9] Murillo O,Doménech A,Garcia A,et al.Efficacy of high dose of levofloxacin in experimental foreigh-body infection by methicillin-susceptible staphylococcus aureus.Antimicrob Agents Chemother,2006,50:4011-4017.

[10] 王剛,孫備,姜洪池.血胰屏障及其臨床意義.中國實用外科雜志，2008，28:389-391.

[11] Fischman AJ,Babich JW,Bonab AA,et al.Pharmacokinetics of [18F] trovafloxacin in healthy human subjects studied with positron emission tomography.Antimicrob Agents Chemother,1998,42:2048-2054.

[12] Marchand S,Frasca D,Dahyot-Fizelier C,et al.Lung microdialysis study of levofloxacin in rats following intravenous infusion at steady state.Antimicrob Agents Chemother,2008,52:3074-3077.

[13] Destache CJ,Pakiz CB,Larsen C,et al.Cerebrospinal fluid penetration and pharmacokinetics of levofloxacin in an experimental rabbit meningitis model.J Antimicrob Chemother,2001,47:611-615.

[14] Ito T,Yano I,Masuda S,et al.Distribution characteristics of levofloxacin and grepafloxacin in rat kidney.Pharm Res,1999,16:534-539.

[15] 馬珂,祁金文,俞佳,等.左旋氧氟沙星對大鼠血胰屏障的通透性,中國現代應用藥學雜志,2002,19:237-239.

[16] 張菁,郁繼誠,施耀國,等.左氧氟沙星藥代動力學/藥效學研究,中華醫學雜志,2005,85:1926-1932.

2009-11-26)

(本文編輯：屠振興)

Pharmacokineticsoflevofloxacininratpancreas

LIUDe-ding,XIAOHe-ping,WANGZhuo,ZHOUJia,SONGBin,YANGLin,LIURui,HUANGYi.

DepartmentofGeneralSurgery,ChanghaiHospital,SecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200433,China

HUANGYi,Email:huangliur@163.com,LIURui,Email:huangliur@163.com

ObjectiveTo investigate the pharmacokinetics of levofloxacin in rat′s pancreatic tissue.MethodsPancreatic tissue and blood were sampled in vivo by microdialysis simultaneously. The concentrations of levofloxacin in both blood and tissues were measured by high performance liquid chromatography. All date were analyzed by WinNonlin software.ResultsThe maximum concentration of free levofloxacin in blood and pancreatic tissue were (65.23±12.9) μg/ml at 10min and (30.56±3.22) μg/ml at 20 min, respectively, then both continuously decreased. Concentration of free levofloxacin in pancreatic tissue was higher than that in blood from 20min to 100min, then returned to similar level. The area under the concentration curve (AUC) of unbound levofloxacin was (2465.11±258.56) min·μg-1·ml-1in pancreas, and (2914.38±205.73) min·μg-1·ml-1in blood.ConclusionsMicrodialysis with reversed phase high performance liquid chromatography established in this essay could be used to determine the pharmacokinetics of levofloxacin objectively. High concentration of levofloxacin in pancreatic tissue and blood was observed.

Levofloxacin； Microdialysis； Pharmacokinetics； Pharmacodynamics； High performance liquid chromatography

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.02.007

國家科技重大專項《復發性結核病治療的研究》(2008ZX10003-015)

200433 上海，第二軍醫大學附屬長海醫院普外科(劉德鼎、劉瑞、宋彬、楊琳)，呼吸內科(黃怡)，藥學部(王卓、周佳)；上海市肺科醫院(肖和平)

黃怡，Email：huangliur@163.com；劉瑞，Email：huangliur@163.com