巨噬細胞移動抑制因子在大鼠急性壞死性胰腺炎肺損傷中的作用

趙小勇 程雪燕 田新 邵磊 石書偉 莫小華

·論著·

巨噬細胞移動抑制因子在大鼠急性壞死性胰腺炎肺損傷中的作用

趙小勇 程雪燕 田新 邵磊 石書偉 莫小華

目的檢測急性壞死性胰腺炎(severe acute pancreatitis, ANP)大鼠肺組織巨噬細胞移動抑制因子(MIF)mRAN表達及TNF-α含量，探討它們在ANP肺損傷中的作用機制。方法40只SD大鼠隨機分成對照組及ANP 3、6、12 h組。采用5%牛磺膽酸鈉(0.1 ml/100 g體重)膽胰管逆行注射方法制備ANP模型。取血檢測血清淀粉酶。取胰腺組織和肺組織行病理學檢查，并稱重計算其濕/干重比。采用RT-PCR法檢測肺組織MIF mRNA表達，放免法測定肺組織TNF-α含量。結果ANP 組血淀粉酶、胰腺和肺組織濕/干重比顯著升高，病理損傷隨時間延長逐漸加重。ANP 3、6、12 h組肺組織TNF-α含量分別為(0.69±0.07)ng/ml、(1.64±0.10)ng/ml和(0.92±0.11)ng/ml；MIF mRNA表達量分別為1.97±0.09、2.55±0.23、3.29±0.26，均顯著高于對照組的(0.19±0.06)ng/ml和1.21±0.34(P值均lt;0.01)。肺組織MIFmRNA表達與肺組織病理損傷、肺濕/干重比、TNF-α含量均呈正相關，相關系數分別為r=0.637、r=0.684、r=0.858，P值均lt;0.01。肺組織TNF-α含量與肺損傷、肺濕/干重比均呈正相關，相關系數分別為r=0.540和r=0.421，P值均lt;0.01。結論ANP大鼠肺組織MIFmRNA過表達，TNF-α含量顯著增加，它們共同參與肺損傷的發生。

胰腺炎，急性壞死性； 肺損傷； 巨噬細胞游走抑制因子； 腫瘤壞死因子α

約1/3的重癥急性胰腺炎(SAP)患者會發展到急性肺損傷(acute lung injury,ALI)和急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory dysfunction syndrome,ARDS)，約60%的患者在SAP發病的第一周因ALI/ARDS病死[1]。因此，探討SAP并發ALI/ARDS的發病機制對于降低SAP患者病死率有重要意義。

巨噬細胞移動抑制因子( macrophage migration inhibitory factor,MIF)廣泛分布于腦垂體、肺臟、肝臟、腎上腺、子宮等部位，其主要功能是抑制巨噬細胞游走，促進其在炎癥局部浸潤，并分泌多種細胞因子。它也是糖皮質激素抗炎作用的內源性拮抗物[2]，在ALI/ARDS的發病過程中起重要作用[3]。因此，本實驗檢測急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠肺組織MIF基因表達，探討其在ANP并發ALI/ARDS發病機制中的作用。

材料與方法

一、實驗動物與分組

成年SD大鼠40只，體重250～300 g，清潔級，雌雄不限，購自昆明醫學院實驗動物中心。按數字表法隨機分為對照(3 h)組,ANP 3、6、12 h組，每組10只。采用膽胰管逆行注射5%牛磺膽酸鈉(Sigma公司)0.1 ml/100 g體重方法制備ANP模型。對照組僅翻動胰腺后關腹。按各時間點處死大鼠，取血，并取胰腺和肺組織。

二、觀察指標及方法

1．血清淀粉酶：采用全自動生化分析儀。

2．胰腺和肺組織濕/干重比：取胰腺體部和右肺下葉組織用電子稱稱其濕重，置于80℃烘箱烘烤24 h后稱其干重，計算胰腺、肺組織的濕/干重比。

3．胰腺和肺臟組織病理學檢查：取胰尾、右肺中葉組織，常規切片、HE染色。由病理科醫師閱片，并參考Schimidt等[4]標準對胰腺進行評分，參考 Osman等[5]的標準對肺組織評分。

4．肺組織TNF-α測定：取左肺新鮮組織，吸去血跡，稱重約400 mg,放入生理鹽水研磨制成勻漿，離心，取上清液于-20℃保存。采用TNF-α放射免疫試劑盒(天津九鼎醫學生物工程有限公司)檢測。

5．肺組織MIF mRNA檢測：取新鮮肺組織，在液氮中研磨成粉末，應用RNA抽提試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)抽取總RNA。應用RT-PCR方法檢測MIF mRNA表達。MIF上游引物 5′-ATG-CCTATGTTCATCGTGAAC-3′，下游引物5′-GGC-TCAAGCGAAGGTGGAAC-3′，擴增片斷341 bp；內參β-actin上游引物5′-TGGAATCCTGTGGCATCCATG-3′，下游引物5′-TAAAACGCAGCTCAGTAACAG-3′，擴增片斷349 bp。引物由上海生工生物工程技術服務公司合成。先采用Revert AidTM First Strand CDNA Systhesis Kit(Fermentas公司)逆轉錄成cDNA。PCR反應： 95℃ 3 min，94℃ 30 s、53℃ 30 s、72℃ 30 s，33個循環，最后72℃ 7 min。產物經電泳分離，圖像自動捕獲系統掃描，以MIF與β-actin電泳帶灰度值之比作為mRNA表達的相對值。

三、統計學處理

結 果

一、血清淀粉酶活性變化

對照組血淀粉酶活性為(524.10±122.92)U/L，ANP 3、6、12 h組分別為(4365.20±884.37)U/L、(9019.70±7383.15)U/L和(11534.90±7165.35)U/L，較正常對照組顯著升高(Plt;0.01)。

二、腹水量、胰腺濕/干重比及病理組織學改變

ANP 3、6、12 h組大鼠腹水量為(6.44±2.35)ml、(8.96±3.63)ml和(13.19±9.21)ml，均顯著多于對照組的(0.51±1.10)ml(P值均lt;0.01)；胰腺濕/干重比為6.53±0.73、8.25±0.83、10.44±0.96，均顯著高于對照組的4.36±0.36(P值均lt;0.01)。

對照組胰腺肉眼無明顯變化，光鏡見胰腺組織結構清晰，細胞形態正常(圖1a)。ANP 3 h組胰腺腫脹明顯，出現點片狀紫褐色壞死區；光鏡見腺泡間質水腫，小葉間隙增大，有點灶狀壞死區，有少量炎細胞浸潤(圖1b)。6 h組胰腺質地變硬，可見散在分布的皂化斑;光鏡見腺泡破壞，壞死區擴大，有凝固性、脂肪性壞死(圖1c)。12 h胰腺有大片壞死灶，大網膜、腸系膜、腹后壁、腸壁可見大量黃色皂化斑；光鏡見腺泡小葉結構破壞，血管破裂出血，壞死區有大量中性單核巨噬細胞浸潤(圖1d)。對照組和ANP 3、6、12 h組的胰腺病理評分分別為0.15±0.34、2.75±1.27、6.35±1.23、8.95±2.24，ANP各時間點組均較對照組顯著增加(Plt;0.01)。

三、肺組織濕/干重比及病理改變

對照組和ANP 3、6、12 h組的肺組織濕/干重比分別為4.24±0.25、5.61±9.62、6.90±0.53、8.45±0.80，ANP各組均較對照組顯著增加(Plt;0.01)。對照組肺組織結構清晰，肺泡壁完整 ，肺間質無滲出(圖2a)。ANP 3 h組肺臟體積稍增大；鏡下見肺間質增寬，充血水腫，有少量炎性細胞浸潤(圖2b)。6 h后肺體積增大更為顯著；光鏡下間質明顯增寬，炎性細胞浸潤明顯增多，肺泡腔出血(圖2c)。12 h后肺間隔增寬，大量炎癥細胞浸潤，肺泡腔內大量滲出物，肺泡腔塌陷，局灶性實變等(圖2d)。對照組和ANP 3、6、12 h組的肺病理評分分別為0.25±0.35、3.65±0.47、3.80±1.01、4.60±1.84，ANP各組均較對照組顯著增加(Plt;0.01)。

四、肺組織MIF mRNA表達

對照組肺MIF mRNA低水平表達，表達量為1.21±0.34。ANP 3、6、12 h的MIF mRNA，表達量分別為1.97±0.09、2.55±0.23、3.29±0.26，均較對照組顯著增加(P值均lt;0.01，圖3)。

五、肺組織TNF-α含量

對照組和ANP 3、6、12 h組肺組織TNF-α含量分別為(0.19±0.06)ng/ml、(0.69±0.07)ng/ml、(1.64±0.10) ng/ml和(0.92±0.11 )ng/ml，ANP各組較對照組顯著增加(P值均lt;0.01)。

六、相關性分析

肺組織MIF mRNA表達與肺組織病理損傷、肺濕/干重比、TNF-α含量均呈正相關，相關系數分別為r=0.637、r=0.684、r=0.858，P值均lt;0.01。肺組織TNF-α含量與肺損傷，肺濕/干重比均呈正相關，相關系數分別為r=0.540和r=0.421，P值均lt;0.01。

討 論

大量研究顯示，在急性胰腺炎發病早期即存在炎性細胞因子過度釋放和失控的全身炎癥反應。TNF-α是ANP發病后較早產生的細胞因子，其升高的程度與胰腺損傷程度直接相關聯[6]。它也是引起ALI的啟動因子[7]。徐軍等[8]和Norman等[9]報道ANP大鼠肺TNF-α含量隨制模時間延長不斷升高。Winder等[10]用TNF-α拮抗劑治療可明顯減輕肺水腫。本實驗提示,ANP組肺組織TNF-α水平明顯高于對照組，于6 h達到高峰，后略有下降,且肺組織TNF-α水平與肺的損傷程度呈正相關，提示肺組織TNF-α參與肺損傷的發生。

圖1 對照組(a)和ANP 3(b)、6(c)、12 h(d)組胰腺組織病理改變(HE ×100)

圖2 對照組(a)和ANP 3(b)、6(c)、12 h(d)組肺組織病理改變(HE ×100)

圖3 對照組(1，2)及ANP 3 h(3,4)、6 h(5，6)、12 h(7.8)組肺組織β-actin mRNA和MIF mRNA的表達

巨噬細胞移動抑制因子(MIF)作為一種炎性細胞因子，一種神經內分泌激素和一種催化酶，在炎癥反應和免疫調節中發揮著重要作用。MIF能抑制巨噬細胞游走，促進巨噬細胞在炎癥局部浸潤、增生、激活及分泌一些細胞因子。ANP時，炎癥介質、細胞因子刺激肺臟巨噬細胞活化，釋放MIF，MIF可刺激單核巨噬細胞釋放各種細胞因子和炎癥介質，導致ALI/ARDS。本實驗結果顯示，隨著胰腺病變的加重，肺組織出現中性粒細胞、單核巨噬細胞浸潤，MIF mRNA表達增加，并與肺損傷程度呈正相關，提示MIF介導了巨噬細胞在肺組織的浸潤，同時巨噬細胞可產生MIF，形成正反饋，加重肺的損傷，與Donnelly等[11]的結果一致。Bernhagen等[12]用TNF-α誘導巨噬細胞釋放MIF，觀察到MIF反過來刺激巨噬細胞釋放TNF-α，使用抗MIF抗體則可降低腹膜炎鼠血漿TNF-α水平，提示TNF-α和MIF協同作用于前炎癥反應環路，致病情加重，預后不良。本組肺組織MIFmRNA表達與TNF-α水平同步升高，呈顯著正相關，也表明它們共同促進ALI發生。

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2009-03-06)

(本文編輯：呂芳萍)

RoleofintrapulmonaryexpressionofMIFmRNAinacutelunginjuryofratswithacutenecrotizingpancreatitis

ZHAOXiao-yong,CHENGXue-yan,TIANXin,SHAOLei,SHIShu-wei,MOXiao-hua.

DepartmentofPancreaticSurgery,PeoplesHospitalofJiaozuo,Jiaozuo454002,China

MOXiao-hua，Email:mxh580@yahoo.com.cn

ObjectiveTo investigate the relationship between the expression of MIF mRNA and TNF-α in the lung tissue of rats with acute necrotizing pancreatitis (ANP) and explore their mechanism of action in acute lung injury during the course of ANP.MethodsA total of 40 Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups (n=10 in each group): the sham operation (SO) group, ANP 3h group, 6h group, 12h group. The model of ANP was induced by retrograde injection of 5% sodium taurocholate (0.1 ml/100 g) into the biliary and pancreatic duct. The level of serum amylase was determined; pancreatic and lung tissues were harvested for pathological examination, and wet/dry weight ratios were estimated. Intrapulmonary expression of MIF mRNA was assayed by semi-quantitative RT-PCR. TNF-α in pulmonary homogenate was measured by immunoradiometric assay.ResultsSerum amylase, wet/dry weight ratios of pancreatic and lung tissues all significantly increased, and pathological injuries aggravated with time in ANP groups. Levels of TNF-α in ANP 3h, 6h, 12h group were (0.69±0.107) ng/ml, (1.64±0.10) ng/ml and (0.92±0.11)ng/ml, and expression of MIF mRNA were 1.97±0.09, 2.55±0.23, 3.29±0.26, which were significantly higher than those in control group [(0.19±0.06)ng/ml, 1.21±0.34,Plt;0.01]. Intrapulmonary expression of MIF mRNA was positively associated with lung pathological injuries, wet/dry weight ratio, and TNF-α(r=0.637,r=0.684,r=0.858,Plt;0.01). Intrapulmonary levels of TNF-α was positively associated with lung pathological injuries, wet/dry weight ratio (r=0.540,r=0.421,Plt;0.01).ConclusionsMIF mRNA was over-expressed and level of TNF-α was significantly increased in pulmonary tissue in rats with ANP, and this may be one of the mechanisms in the pathogenesis of lung injury in ANP.

Pancreatitis,acute necrotizing; Lung injury; Macrophage migration-inhibitory factors; Tumor necrosis factor-alpha

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.02.012

云南省教育廳科研基金資助項目(5Z0314C)

454002 焦作，河南省焦作市人民醫院胰腺外科(趙小勇、程雪燕、田新、邵磊、石書偉)；云南省昆明醫學院第二附屬醫院腹部微創外科(莫小華)

莫小華,Email:mxh580@yahoo.com