蜂蠟中二十八烷醇的分離純化技術(shù)研究

唐翠芳 吳珍紅 繆曉青

（福建農(nóng)林大學(xué)蜂療研究所，福建省神蜂科技開發(fā)有限公司，福州350002）

二十八烷醇的外觀為白色粉末或鱗片狀晶體，溶點(diǎn)81℃～83℃，比重0.1783(85℃)可溶于熱乙醇、乙醚、苯、甲苯、氯仿、二氯甲烷、石油醚等有機(jī)溶劑,不溶于水，對酸、堿、還原劑、光、熱穩(wěn)定，不吸潮[1]。二十八醇廣泛分布于動(dòng)物的表皮和內(nèi)臟、昆蟲分泌的蠟質(zhì)如蟲白蠟、蟲膠蠟、蜂蠟以及植物根、莖、葉、殼、籽仁的脂質(zhì)中[2]。二十八烷醇是世界公認(rèn)的抗疲勞物質(zhì)[3～4]。此外，人們對二十八醇的毒性進(jìn)行了專門研究，通過急性毒性試驗(yàn)證實(shí)白鼠LD50=18000 mg/kg(白鼠口服)，安全性比食鹽高(食鹽LD50=3000 mg/kg)。本研究以蜂蠟為原料，提取其中的二十八烷醇，研究得到高純度二十八烷醇的制備工藝方法。

1 實(shí)驗(yàn)材料

原料蜂蠟（福建省神蜂科技開發(fā)有限公司提供），二十八烷醇標(biāo)品（Sigma公司，純度99%）；其他均為分析純試劑。氣質(zhì)聯(lián)用儀等設(shè)備。

2 試驗(yàn)方法

采用“外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法”測定二十八烷醇含量[5]。氣相色譜條件：島津GC-2010氣質(zhì)聯(lián)用儀；電子轟擊源（EI）：Toev；色譜柱：RXiTM-5ms；接口溫度：260℃；離子源溫度：200℃，柱溫：80℃以20℃/min升至 300℃保持 10 min；進(jìn)樣量：1μL，進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣；載氣：氦氣，柱流量：1.46mL/min；Scan掃描方式:50～617.00m/z，SIM 掃描方式:目標(biāo)離子：104m/z，參考離子：103m/z，78m/z。采用峰面積歸一化法定量。

將粗蜂蠟用200目的濾布包裹置于80℃熱水中熔融，棄雜，將熔融的蜂蠟靜置冷卻并加入適量95%乙醇，煮沸20min趁熱倒出乙醇溶液，再重復(fù)一次。抽濾，再用冷乙醇洗滌兩次，除去冷乙醇溶解物。將50g精制蜂蠟和6.79g KOH加入到95%乙醇溶液125mL，在90℃下進(jìn)行皂化4h，皂化過程中隨時(shí)搖動(dòng)三口燒瓶以助充分皂化。以所得的皂化物中粗醇得率為指標(biāo)，選擇最佳萃取溶劑、料液比、萃取溫度、萃取時(shí)間對皂化物進(jìn)行萃取。

2.1 萃取溶劑及用量對粗醇得率的影響

50g精制蜂蠟皂化完全后停止攪拌并降溫至50℃，然后分別加入100mL苯、甲苯、120#汽油，攪拌30 min，再加入100 mL蒸餾水，攪拌10 min，于50℃保溫靜置分層，液液相分離，取有機(jī)溶劑萃取相于25℃冷析結(jié)晶，抽濾，洗滌，得粗醇。重復(fù)3次。

萃取劑 100mL，150mL，200mL，250mL 攪拌 30 min，再加入100mL蒸餾水，攪拌10min，于50℃保溫靜置分層，液液相分離，取有機(jī)溶劑萃取相于25℃冷析結(jié)晶，抽濾，洗滌，得粗醇。重復(fù)3次。

2.2 萃取溫度對粗醇得率的影響

取4個(gè)500mL三口燒瓶，在每個(gè)三口燒瓶中皂化50g精制蜂蠟，皂化完全后停止攪拌，分別降溫至50℃，60℃，70℃，80℃，在已確定的最佳萃取劑及其用量條件下攪拌30min，再加入100mL蒸餾水，攪拌10 min，于50℃保溫靜置分層，取有機(jī)溶劑萃取相于25℃冷析結(jié)晶，抽濾，洗滌，得粗醇。重復(fù)3次。

2.3 萃取時(shí)間對粗醇得率的影響

取4個(gè)500mL三口燒瓶，在每個(gè)三口燒瓶中皂化50g精制蜂蠟，皂化完全后停止攪拌，分別降溫至60℃，在已確定的最佳萃取劑量及溫度下攪拌30min，40min，50min，60min，再加入 100mL 蒸餾水，攪拌 10 min，于50℃保溫靜置分層，液液相分離，取苯萃取相于25℃冷析結(jié)晶，抽濾，洗滌，得粗醇。重復(fù)3次。

2.4 蒸餾水對粗醇得率的影響

取4個(gè)500mL三口燒瓶，在每個(gè)三口燒瓶中皂化50g精制蜂蠟皂化完全后停止攪拌分別降溫至60℃，在已確定的最佳萃取條件下分別加入50mL，75mL，100mL，125mL 蒸餾水，攪拌 10min，于 50℃保溫靜置分層，液液相分離，取苯萃取相于25℃冷析結(jié)晶，抽濾，洗滌，得粗醇。重復(fù)3次。

2.5 最佳萃取工藝參數(shù)的確定

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，確定最佳萃取工藝參數(shù)。萃取物經(jīng)過重結(jié)晶法進(jìn)行純化。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同萃取劑及用量對粗醇得率的影響

苯、甲苯和120#汽油萃取后粗醇得率分別為35.13%，38.48%，38.35%，甲苯和120#汽油的萃取效果較好，溶劑性質(zhì)、溶劑價(jià)格、操作難易、毒性和產(chǎn)品收率等因素的篩選，選擇120#汽油為最佳提取溶劑，避免苯類強(qiáng)毒性溶劑在試驗(yàn)中對人的傷害。

120#汽油用量分別為 100mL，150mL，200mL,250mL時(shí)，粗醇得率分別為32.11%，38.35%，40.08%，40.95%。可以看出萃取劑的用量越大粗醇得率越高，但隨著萃取劑用量的不斷增加，粗醇得率增加越來越緩慢。萃取劑用量在150mL和200mL時(shí)粗醇得率相差1.77%，200mL和250mL時(shí)得率僅相差0.87%。從經(jīng)濟(jì)角度看萃取劑的用量宜選用150mL。

3.2 萃取溫度對粗醇得率的影響

萃取溫度為 50℃，60℃，70℃，80℃時(shí)粗醇得率分別為 38.35%，40.15%，40.32%，38.17%。60℃和70℃時(shí)粗醇得率幾乎相等，溫度再升高時(shí)粗醇得率反而降低，因此萃取溫度宜選用60℃。

3.3 蒸餾水對粗醇得率的影響

萃取劑∶蒸餾水（mL∶mL）為 150∶50，150∶75，150∶100，150∶125 時(shí)，粗醇得率為 40.15%，42.38%，40.01%，38.65%，當(dāng)萃取劑與蒸餾水的比例為150 mL∶75 mL時(shí)，粗醇得率最高。

3.4 萃取時(shí)間對粗醇得率的影響

萃取 30min，40min，50min，60min 粗醇，得率分別為40.15%，41.37%，42.89%，43.41%，萃取時(shí)間越長，粗醇得率越高，但隨時(shí)間的延長粗醇得率增加的速度越慢，50min和60min的得率只相差0.5%。

3.5 最佳萃取工藝參數(shù)的確定

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上隨著萃取時(shí)間的延長，萃取劑用量的增大，脂肪醇得率逐漸提高；隨著萃取溫度升高，脂肪醇得率先提高后降低。選取120#為萃取劑，萃取劑用量(A)、萃取溫度(B)、萃取時(shí)間(C)，萃取劑與蒸餾水比(D)為影響因素，采用L9（34）的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)來確定最佳皂化工藝參數(shù)。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

由正交試驗(yàn)結(jié)果的極差R的大小得出結(jié)論，影響粗醇得率大小的順序依次為：A＞D＞B＞C，由k值得粗醇得率最高的萃取條件為A2B3C3D2，即萃取時(shí)間為50min；萃取溫度為70℃；萃取劑與蒸餾水的用量比為 150mL∶75mL。

4 結(jié)論

以蜂蠟為原料分離二十八烷醇的最優(yōu)萃取條件為：萃取劑120#汽油，萃取時(shí)間50 min,萃取溫度70℃,萃取劑用量150 mL，蒸餾水用量75 mL，將萃取物以三氯甲烷/正己烷（3∶1），固液比為 1∶15，重結(jié)晶溫度20℃，結(jié)晶6次時(shí)，可以制得最高純度的二十八烷醇，純度為57.28%。

盡管二十八烷醇及其制品的價(jià)格相對較高，但由于其獨(dú)特的功能和安全性，仍然受到消費(fèi)者的青睞。開發(fā)含二十八烷醇的具提高耐力及抗缺氧能力的運(yùn)動(dòng)飲料、運(yùn)動(dòng)糖果、糕點(diǎn)等產(chǎn)品，市場前景非常廣闊。

[1]宋建華,劉正陽,程建新等.新型健康食品添加劑二十八烷醇的開發(fā)研究.廈門大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)[J],1998,37(3):414～418.

[2]王興國,劉元法,倪伯文等.二十八醇的分布與功能[J].中國油脂,2002,2:38～40.

[3]Cureton TK.The physiological effects of wheat germ oil on human in experience[M].Sp ringfield?inois,U.S.A,C.C.Thomas Publishesr,1978.

[4]Cureton TK.Effects of wheat germ oil on human in experience[M].U SA,IIIinois,Charles Thomas Publishesr,1972.

[5]陳芳,閏紅,蔡同一.氣相色譜法測定糠蠟提取物中二十八烷醇和三十烷醇[J].食品科學(xué),2003,24(2):119～121.