TNF-α基因多態性與2型糖尿病患者輕度認知功能障礙的相關性

沈芳芳 謝 云 趙 霞 孟憲海 汪瑋琳 韓麗萍 齊秀英

隨著對糖尿病研究的逐步深入，很多學者認為糖尿病與認知障礙之間有明顯的相關性，它是誘發Alzheimer病（Alzheimer’s disease，AD）的一個危險因素[1]。因此，對糖尿病患者認知功能障礙的易感因素，尤其遺傳易感性研究對篩選出AD的高危人群及預防和延遲T2DM患者認知減退具有重要意義。為探討TNF-α基因多態性與T2DM合并輕度認知功能障礙（MCI）的關系，本研究分析TNF-α2等位基因在T2DM合并MCI發病中的作用，及T2DM合并MCI的相關危險因素。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2008年5月—2009年1月在天津醫科大學代謝病醫院住院的198例2型糖尿病患者作為調查疾病史；癲；影響認知功能測試的其他嚴重軀體疾病。

1.2 方法

1.2.1 采集資料 分別采集研究對象的性別、年齡、家族史、病程、空腹血糖（FBG）、餐后2 h血糖（P2BG）、糖化血紅蛋白（HBA1c）、糖尿病并發癥以及是否使用胰島素治療等項目，并計算體質量指數（BMI）。

1.2.2 檢測TNF-α-308A/G基因多態性 應用PCR-RFLP法進行檢測。（1）模板DNA提取:抽取空腹肘正中靜脈血2～3 mL，EDTA抗凝，利用血液基因組DNA抽提試劑盒（大連TaKaRa公司）提取外周血白細胞DNA。（2）PCR擴增：上游引物為 5′－AGG CAA TAG GTT TTG AGG GCC AT－3′，下游引物為 5′－TCC TCC CTG CTC CGA TTC CG－3′。PCR 條件為 94℃5 min預變性，35個循環（94℃1 min變性，59℃45 s退火，72℃6O s延伸），72℃5 min終末延伸；擴增產物為107 bp。（3）PCR產物以限制性核酸內切酶NcoⅠ在37℃酶切1 h，2.5%瓊脂糖凝膠電泳分離酶切片段，溴化乙錠染色，在紫外燈下觀察基因型結果。（4）序列分析：由天根生化科技（北京）有限公司進行PCR產物的純化和測序。

1.3 統計學方法 所有分析應用SPSS 11.5統計軟件包完成。計量資料用均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗。計數資料用率或構成比表示，組間的比較采用χ2檢驗。等位基因頻率、基因型頻率的分析采用χ2檢驗。T2DM合并MCI危險因素的分析采用非條件Logistic回歸分析。對象。2型糖尿病的診斷根據1999年WHO診斷標準，運用簡易智能精神狀態檢查量表（MMSE）、畫鐘測驗（CDT），對每位受檢者的認知功能進行綜合評定：MMSE包括定向力、記憶力、注意力和計算力、回憶能力、語言能力5個方面的檢查，滿分為30分；CDT采用國際上普遍采用4分法計分。依據《2006年中國防治認知功能障礙專家共識》：23分＜MMSE＜27分，CDT 0～2分的調查者診斷為MCI。調查對象中的40例MCI患者作為T2DM MCI組，從認知功能正常組中隨機抽取80例患者作為T2DM非MCI組。排除標準：嚴重低血糖以及糖尿病酮癥酸中毒等昏迷史；退行性神經系統疾病，如帕金森病、Down綜合征等；在3個月內有急性腦血管

2 結果

2.1 MCI組和非MCI組臨床及生化指標比較 2型糖尿病患者MCI組與非MCI組的年齡、病程、DM家族史、BMI、P2BG、HbA1c、DM 視網膜病變、DM 周圍神經病變、高血壓比較差別有統計學意義（P＜0.05或 P＜0.01），性別、FBG、總膽固醇、DM 腎病、冠心病以及胰島素治療的差別無統計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 TNF-α-308A/G基因多態性分析 TNF-α基因在-308位點為G時定義為TNF-α1，為A時定義為TNF-α2。TNF-α PCR產物經限制性核酸內切酶NcoⅠ酶切后，TNF-α-308AA基因型電泳可見：107 bp 1條帶；TNF-α-308 GG基因型電泳可見：87 bp和20 bp 2條帶；TNF-α-308 GA基因型電泳可見：107 bp、87 bp和 20 bp 3條帶，見圖1。2組 TNF-α-308A/G基因型及等位基因的分布差別有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01），見表2。

表1 2型糖尿病患者MCI組和非MCI組臨床及生化指標比較 （±s或構成比）

表1 2型糖尿病患者MCI組和非MCI組臨床及生化指標比較 （±s或構成比）

*P＜0.05，**P＜0.01；表2 同

組別MCI組非MCI組t或 χ2 n 40 80性別（男/女）15/25 36/44 0.61年齡（歲）68.70±7.21 61.09±6.70 5.72**病程（a）14.03±8.54 8.79±6.05 3.87**DM家族史（例）13 47 7.35**組別MCI組非MCI組t或 χ2 n 40 80 BMI（kg/m2）25.09±2.86 26.28±3.27 1.96*FBG(mmol/L)10.42±1.79 10.57±3.47 0.30 P2BG(mmol/L)15.33±2.19 13.47±3.72 3.31**HbA1c 0.095±0.022 0.085±0.022 2.41*組別 n MCI組非MCI組t或 χ2 40 80總膽固醇（mmol/L）5.81±1.35 5.34±1.38 1.78 DM腎病例（%）18（45）36（45）0.00 DM視網膜病變 例（%）26（65）32（40）6.67*DM周圍神經病變 例（%）31（76）41（51）7.66**組別MCI組非MCI組t或 χ2 n 40 80高血壓例（%）31（76）42（52）7.00**冠心病例（%）24（60）59（74）2.36胰島素治療例（%）27（68）64（80）2.27

圖1 TNF-α基因PCR產物限制性酶切電泳圖

表2 TNF-α-308A/G基因多態性分布

2.3 非條件Logistic回歸分析 將MCI組和非MCI組臨床及生化指標中差別有統計意義的9項指標和TNF-α基因型作為自變量，以T2DM是否合并MCI作為因變量，進行非條件Logistic回歸。結果表明，TNF-α、糖尿病周圍神經病變、視網膜病變、年齡、餐后2 h血糖是T2DM合并MCI的危險因素，見表3。

表3 非條件Logistic回歸分析

3 討論

目前醫學界公認的MCI指介于正常老化和癡呆之間的一種認知缺損狀態，主要表現在記憶減退與年齡的不相稱，但沒有達到AD的標準。Logroscino等[2]通過大人群前瞻性研究發現，老年T2DM患者基線認知功能測試的得分低于非糖尿病者，并且在2～6年的隨訪過程中其認知功能下降的危險性增加。

糖尿病患者慢性高血糖及其慢性代謝異常可造成腦血管損害和神經元變性。有研究表明，高血壓、糖尿病、高膽固醇和腦白質變性及腦梗死與MCI有關，提示血管危險因素可能是MCI的重要原因[3]。Akisaki等[4]研究發現，T2DM患者的認知功能障礙主要與糖尿病微血管并發癥有關，與本文調查結果相似。本研究顯示MCI與糖尿病視網膜病變和周圍神經病變有關，后者均為糖尿病常見的微血管并發癥；未見糖尿病腎病在2組之間有差別，可能與例數較少有關。國外研究表明，高血糖時醛糖還原酶活性顯著增高，使葡萄糖轉化為山梨醇增加，可引起神經細胞高滲和水腫[5]。此外，高血糖時tau蛋白和 β 淀粉樣蛋白（amyloid β protein，Aβ）發生非酶糖基化，形成糖基化終末產物（AGEs），后者通過受體途徑刺激免疫應答反應或直接作用產生氧化損傷，導致神經細胞功能障礙甚至死亡。

人TNF-α基因啟動子區域-308位點存在G/A多態性并與TNF-α的表達水平有關。與TNF-α1等位基因比較，TNF-α2基因使TNF-α表達增加，TNF-α的濃度也增加[6]。在AD及MCI患者的大腦、腦脊液及外周血中發現TNF-α的升高。Culpan等[7]發現AD患者TNF-α2等位基因頻率異常增高，而且攜帶TNF-α2等位基因者發病年齡較早。目前大多學者認為TNF-α基因多態性增加了AD的發病風險[8]。Bermejo等[9]研究表明AD腦內炎癥反應增強，活化的炎性細胞和大量炎性細胞因子（主要包括IL和TNF）通過一系列信號傳導通路促使Aβ沉積以及老年斑和神經纖維纏結的形成，造成神經元的損傷和死亡。

本研究結果顯示，TNF-α與DM合并MCI的遺傳易感性相關，推斷TNF-α2等位基因是DM罹患MCI的危險因素。但DM合并MCI的發生為多因素參與，且TNF-α基因多態性在不同人種、地區的差異及與其發病機制目前尚未完全清楚。本研究例數有限，需進一步深入研究。同時，強調早期、有效地治療DM患者的血糖、并發癥等可能是防止MCI發生的有效措施，對預防癡呆可能起到一定的作用。

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