金葡菌對高糖狀態下THP-1人單核細胞表達iNOS和IL-1β的影響*

陳 櫻 孟 東 孫 培 王寶利 鄧為民 姚 智

糖尿病細菌感染一直是困擾糖尿病患者和廣大醫生的難題，雖然有大量廣譜抗生素應用于臨床，但感染的發生率仍呈增高的趨勢，感染引起的糖尿病患者死亡仍占較高比例[1]。研究表明，糖尿病高血糖可以影響單核細胞的趨化、黏附作用[2-3]，促進細胞調亡。本研究旨在探討高糖狀態下，金黃色葡萄球菌（金葡菌）對THP-1人單核細胞表達誘導型一氧化氮合酶（iNOS）和白細胞介素（IL）-1β的影響，以期從細胞免疫學角度了解糖尿病患者感染的發病機制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）單核細胞和培養試劑：人單核細胞株THP-1購自北京協和醫學院。RPMI1640培養液為美國GIBCO公司產品，胎牛血清（FBS）為美國Hyclone公司產品。（2）菌種和調理素：金葡菌標準菌26001株（天津市金章科技發展有限公司），普通培養基37℃培養18 h。挑取單個菌落，用生理鹽水將標準菌株制成約1.5×108CFU/mL（CFU：集落形成單位）細菌懸液，使用新鮮人混合血清調理1.5 h備用。（3）iNOS、IL-1β表達測定用試劑：TRIzol總RNA分離試劑購自美國Promega公司；RT-PCR試劑盒為美國LIFE TECHNOLOGIES公司產品。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 PRMI1640培基體外培養單核細胞株THP-1，采用 2×2析因分析實驗設計，以高糖（A）、細菌（B）2個因素，每個因素2個水平交叉分為4組，分別為對照組（5.5 mmol/L葡萄糖）、高糖組（25.0 mmol/L葡萄糖）、細菌組（1.5×107CFU/mL金葡菌+5.5 mmol/L葡萄糖）和高糖細菌組（1.5×107CFU/mL金葡菌+25.0 mmol/L葡萄糖）。分組細胞首先以上述2種濃度的葡萄糖培養72 h，再移至六孔培養板，同時細菌組和高糖細菌組加入金葡菌，調整細胞/細菌比例為1∶15，置37℃，270 r/min振蕩孵育1.5 h。測定iNOS和IL-1β的表達情況。

1.2.2 iNOS表達測定 用TRIzol總RNA分離試劑提取細胞RNA，用半定量逆轉錄聚合酶鏈反應（SQ-RT-PCR）法檢測iNOS表達。引物：上游5′-CCAGCTAGCCAAAGTCACCA T-3′，下游 5′-GTCTCGGAGCCATACAGGATT-3′，擴增片段長 354 bp；GAPDH: 上游 5′-AGTCCACTGGCGTCTTCAC-3′，下游 5′-TGATCTTGAGGCTGTTGTC-3′，擴增片段長 240 bp。iNOS表達產物電泳結果采用GeneSnap凝膠圖像采集分析系統（SynGene公司產品）拍照，對凝膠中的特異性條帶進行掃描，用凝膠圖像分析軟件分析，測定其相對光密度，計算各因子與GAPDH的光密度比值作為半定量指標。iNOS基因的PCR擴增條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環，72℃10 min。

1.2.3 IL-1β 表達測定 IL-1β 引物：上游5′-CATCCAGCT TCAAATCTCAC-3′，下游 5′-ACCACTTGTTGGCTTATGTT-3′，擴增片段長333 bp。IL-1β基因PCR擴增條件：94℃預變性 5 min，94℃變性 30 s，50℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，共35個循環，72℃10 min。GAPDH和反應產物分析同1.2.2。

2 結果

2.1 單變量多因素方差分析結果 高糖和細菌及兩者交互效應均影響THP-1人單核細胞表達iNOS和 IL-1β，見表1、2。

2.2 單因素方差分析結果 4組組間iNOS、IL-1β表達水平比較差異均有統計學意義（F分別為49.87、44.63，均P<0.01）。組間的多重比較結果顯示，高糖組與對照組相比細胞表達iNOS和IL-1β均減弱；細菌組與對照組比較iNOS和IL-1β表達均增高；與高糖組比較，高糖細菌組IL-1β表達增高，iNOS表達變化不明顯，見表1、3。

表1 金葡菌對高糖狀態下THP-1人單核細胞表達iNOS和 IL-1β 的影響 （n=5，±s）

表1 金葡菌對高糖狀態下THP-1人單核細胞表達iNOS和 IL-1β 的影響 （n=5，±s）

分組對照組高糖組細菌組高糖細菌組iNOS mRNA/GAPDH 0.645±0.157 0.295±0.085 1.328±0.216 0.377±0.089 IL-1β mRNA/GAPDH 1.154±0.150 0.450±0.082 1.358±0.161 1.048±0.147

表2 多因素方差分析結果

表3 單因素方差分析組間多重比較的q值

3 討論

嚴重感染是糖尿病患者死亡的重要原因之一[4]。糖尿病患者由于血糖升高，蛋白代謝紊亂，免疫功能低下，抵抗力降低等因素，極易造成各類感染，其中呼吸系統、泌尿系統、膽道及皮膚軟組織的感染率分別是非糖尿病患者的2～5倍[1]。且糖尿病患者在高血糖狀態下，感染往往不易控制[5]。因此，研究高糖狀態下免疫細胞的功能有助于了解糖尿病感染的機制。

iNOS是單核細胞產生一氧化氮（NO）的主要限速酶。NO是體內重要的生物活性分子和信號分子。正常情況下，單核細胞釋放的NO具有重要的保護機體的作用。筆者先前研究表明，高糖可以抑制內皮細胞表達內皮型一氧化氮合酶（eNOS）[6]。IL-1β是一個多效性促炎細胞因子，可由巨噬細胞、內皮細胞、平滑肌細胞和成纖維細胞等產生，能促進內皮細胞合成、表達細胞間黏附分子（ICAM）-1和血管細胞黏附分子（VCAM）-1，誘導內皮細胞釋放血小板衍生生長因子（PDGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）等促有絲分裂素，同時促進多形核白細胞與內皮細胞黏附并協同其刺激內皮細胞合成和釋放PDGF和bFGF，誘導細胞外基質蛋白及基質金屬蛋白酶的產生，調節干擾素（IFN）γ產量等[7]。IL-1β的表達在感染損傷后的炎癥反應和平滑肌細胞激活、移行、增殖的各個階段都起著很重要的作用。

細菌能夠刺激細胞產生促炎反應因子IL-1β和TNF-α，并減弱吞噬細胞活性[8]。細菌脂多糖可以通過激活caspase-1誘導THP-1細胞釋放IL-1β[9]。金黃色葡萄球菌是糖尿病感染常見致病菌，金葡溶血素α和殺白細胞素可損傷或殺死單核巨噬細胞和粒細胞。本研究顯示，高糖和金葡菌及二者交互效應均可影響THP-1人單核細胞表達iNOS和IL-1β。高糖使iNOS和IL-1β表達減弱，細菌感染作為獨立因素可使兩指標表達增強；但高糖和細菌感染同時存在時，僅IL-1β表達增強，iNOS表達變化不顯著，提示糖尿病感染患者免疫功能降低與高糖狀態下免疫細胞表達iNOS和IL-1β減弱有關。因此，從改善糖尿病患者細胞免疫功能的角度來講，控制患者的血糖就顯得尤為重要。同時，改善患者免疫細胞功能在一定程度上能控制和減少糖尿病感染的發生。

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