時(shí)間分辨拉曼光譜研究一氧化氮與肌紅蛋白的結(jié)合過程

李 濤 呂 榮 于安池

(中國(guó)人民大學(xué)化學(xué)系,北京 100872)

時(shí)間分辨拉曼光譜研究一氧化氮與肌紅蛋白的結(jié)合過程

李 濤 呂 榮 于安池*

(中國(guó)人民大學(xué)化學(xué)系,北京 100872)

納秒瞬態(tài)拉曼光譜技術(shù)是研究分子結(jié)構(gòu)變化超快動(dòng)態(tài)過程的重要實(shí)驗(yàn)手段之一.而肌紅蛋白(Mb)與小分子配體的結(jié)合過程一直是人們研究的焦點(diǎn).本文旨在利用納秒瞬態(tài)拉曼光譜技術(shù)研究小分子配體NO與肌紅蛋白結(jié)合的動(dòng)力學(xué)過程.通過考察MbNO光解后產(chǎn)物脫氧肌紅蛋白(DeoxyMb)與反應(yīng)物MbNO的ν4特征振動(dòng)峰的強(qiáng)度比值隨激光激發(fā)功率的變化,闡述了利用納秒瞬態(tài)拉曼光譜技術(shù)研究MbNO體系中NO與DeoxyMb結(jié)合過程的可行性.利用納秒瞬態(tài)拉曼光譜技術(shù),獲得了與皮秒時(shí)間分辨拉曼和皮秒時(shí)間分辨吸收相一致的結(jié)合動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果.為研究其它復(fù)雜體系的超快結(jié)合動(dòng)力學(xué)過程提供了一種新的思路.

納秒瞬態(tài)拉曼;皮秒時(shí)間分辨拉曼;皮秒時(shí)間分辨吸收;肌紅蛋白;一氧化氮;結(jié)合過程

肌紅蛋白(myoglobin,Mb)是一種廣泛存在于脊椎動(dòng)物肌肉細(xì)胞中的血紅素蛋白,主要生理功能是為生命有機(jī)體儲(chǔ)存和運(yùn)輸氧氣[1].除此之外,肌紅蛋白還通過可逆地與一氧化碳和一氧化氮等小分子配體結(jié)合與釋放來調(diào)控其他血紅素蛋白的生理功能[2,3].因此,肌紅蛋白又被稱為“生物學(xué)中的氫原子”[4],一直被科學(xué)家們作為一個(gè)模型體系來研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系[5-7].

雖然一氧化碳、一氧化氮和氧氣分子都可以與肌紅蛋白結(jié)合,但它們的結(jié)合動(dòng)力學(xué)行為有著很大的差異[8-23].在短脈沖激光作用下,配體以很快的速度解離(>1013s-1),解離后的一氧化氮在兩三百皮秒內(nèi)便可完全與肌紅蛋白孿生結(jié)合(結(jié)合幅度>95%)[8-17].一氧化碳則相反,不但孿生結(jié)合速度非常慢(微秒量級(jí)),而且結(jié)合幅度也非常小(＜5%)[8-21];氧氣的結(jié)合情況更為復(fù)雜,既有非常快的孿生結(jié)合過程(約為6 ps),又有比較慢的孿生結(jié)合過程(約為30 ns)[12,21-23].對(duì)引起三種配體結(jié)合行為的差異,人們的認(rèn)識(shí)也不盡相同[7,10,11,24-28].一直以來人們認(rèn)為自旋選擇定律是造成三種配體結(jié)合行為差異的內(nèi)在本質(zhì)[24-26,28].在非結(jié)合態(tài),血紅素鐵原子的自旋態(tài)為S=2,而結(jié)合態(tài)中, MbCO的自旋態(tài)為S=0,MbNO的自旋態(tài)為S=1/2, MbO2的自旋態(tài)為S=0.結(jié)合過程中,不同的自旋態(tài)中間體可以參與反應(yīng)從而引起它們結(jié)合行為的差異.但最近強(qiáng)磁場(chǎng)條件下的結(jié)合動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,強(qiáng)磁場(chǎng)對(duì)配體的結(jié)合動(dòng)力學(xué)行為沒有明顯影響[29].此外,Ionascu等[10]同樣提出了“Harpoon”模型和“Doming”模型來解釋三種配體結(jié)合行為的差異.因此,肌紅蛋白與三種小分子配體(O2、NO、CO)結(jié)合過程差異的內(nèi)在原因仍不清楚,仍需更多的實(shí)驗(yàn)來揭示.

時(shí)間分辨拉曼光譜已被廣泛地應(yīng)用于探測(cè)反應(yīng)中間體的結(jié)構(gòu)變化信息和反應(yīng)歷程[30,31].對(duì)于肌紅蛋白體系而言,目前人們主要利用皮秒時(shí)間分辨拉曼光譜技術(shù)研究肌紅蛋白的結(jié)構(gòu)變化信息[30,32,33],利用皮秒時(shí)間分辨拉曼光譜技術(shù)研究小分子配體與蛋白結(jié)合的動(dòng)力學(xué)過程鮮有報(bào)道.此外,納秒瞬態(tài)拉曼光譜同樣可以用于跟蹤觀測(cè)快反應(yīng)中間體的反應(yīng)過程[34-36].與時(shí)間分辨拉曼光譜技術(shù)相比,納秒瞬態(tài)拉曼光譜技術(shù)主要是利用一束激光中單脈沖內(nèi)分子被多次激發(fā)的時(shí)間間隔來觀測(cè)樣品在該時(shí)間量級(jí)的瞬態(tài)過程,即激光的脈沖前沿激發(fā)樣品引起化學(xué)反應(yīng),激光的脈沖后沿探測(cè)化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)行.與皮秒時(shí)間分辨拉曼光譜技術(shù)相比,納秒瞬態(tài)拉曼光譜技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于可以利用高能量的激光對(duì)樣品進(jìn)行激發(fā)及探測(cè),并且有很高的光譜分辨率.缺點(diǎn)是由于是多光子激發(fā)過程,相對(duì)于單光子激發(fā)的時(shí)間分辨拉曼光譜技術(shù),數(shù)據(jù)處理較為復(fù)雜.但由于納秒激光系統(tǒng)相對(duì)于皮秒激光系統(tǒng)容易操作,因此同樣具有廣泛的應(yīng)用前景.目前,納秒瞬態(tài)拉曼光譜技術(shù)對(duì)肌紅蛋白體系的研究工作主要集中在針對(duì)五配位的脫氧肌紅蛋白(DeoxyMb)激發(fā)態(tài)性質(zhì)的研究[34-36],而對(duì)于其應(yīng)用于小分子配體結(jié)合過程中的研究還未見文獻(xiàn)報(bào)道.

本文將利用納秒瞬態(tài)拉曼光譜和皮秒時(shí)間分辨拉曼光譜技術(shù)對(duì)一氧化氮與肌紅蛋白結(jié)合的動(dòng)力學(xué)過程進(jìn)行研究,并與時(shí)間分辨吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較,為人們認(rèn)識(shí)小分子配體(NO)與肌紅蛋白的相互作用增加部分實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

馬心肌紅蛋白購(gòu)于美國(guó)Sigma公司,純度≥90%,-20℃密封保存.其它試劑均為AR級(jí)國(guó)產(chǎn)試劑.取適量Mb,加入800 μL濃度為0.1 mol·L-1,pH為7.2的K2HPO4-KH2PO4緩沖溶液中,室溫超聲1-2 min,待其完全溶解后,離心處理,將上清液轉(zhuǎn)移至厚度為2 mm的石英池中,密封,抽真空,充氬氣,重復(fù)3-5次,除去溶解在溶液中的氧氣.隨后加入10 μL濃度約為 1 mol·L-1經(jīng)過同樣除氧操作的Na2S2O4溶液,充分反應(yīng),將Mb還原成DeoxyMb.最后加入5 μL濃度約為1 mol·L-1經(jīng)過同樣除氧操作的NaNO2溶液,充分反應(yīng),制得MbNO樣品溶液.

納秒瞬態(tài)拉曼實(shí)驗(yàn)光源由Nd:YAG激光和光學(xué)參量振蕩器(Spectra-Physics)產(chǎn)生,波長(zhǎng)為435 nm,脈沖寬度為7 ns,重復(fù)頻率為10 Hz.拉曼信號(hào)采用背向收集方式,信號(hào)由三聯(lián)-三光柵單色儀(TriVista-555)進(jìn)行分光,ICCD(PI-Max:1024 18mm-Gen III)采集.激光的功率通過兩個(gè)格蘭棱鏡調(diào)節(jié).樣品處激光聚焦半徑大小((59±3)μm)由半徑已知的針孔(40 μm)測(cè)定.

皮秒時(shí)間分辨拉曼和吸收實(shí)驗(yàn)裝置是利用飛秒激光系統(tǒng)(Spectra-Physics)搭建的,由振蕩器、千赫茲放大器和其光學(xué)參量放大器組成.皮秒時(shí)間分辨拉曼實(shí)驗(yàn)中,泵浦光和探測(cè)光的波長(zhǎng)分別為540和407 nm,脈沖寬度分別約為150 fs和4 ps,樣品處功率分別為1 mW和90 μW.其中探測(cè)光407 nm是由波長(zhǎng)為814 nm、脈沖寬度為150 fs的激光先經(jīng)過倍頻得到407 nm波長(zhǎng)的光,然后再由單色儀分光獲得.拉曼信號(hào)采用背向收集,經(jīng)單色儀分光,由CCD (Spec-10:400BR/LN)采集.所得拉曼光譜分辨率約為10 cm-1,峰值精確度約為2 cm-1.皮秒時(shí)間分辨吸收實(shí)驗(yàn)中,泵浦光和探測(cè)光的波長(zhǎng)分別為540和414 nm,脈沖寬度分別約為150 fs和4 ps,樣品處功率分別為0.75 mW和30 μW.信號(hào)由光電二極管接收,經(jīng)鎖相放大器處理.兩種實(shí)驗(yàn)的延時(shí)器均放于泵浦光光路上.實(shí)驗(yàn)過程中樣品由自制磁子攪拌器攪拌,以保證激光聚焦區(qū)域樣品始終保持新鮮.

實(shí)驗(yàn)中的所有MbNO樣品濃度均約為50 μmol·L-1.實(shí)驗(yàn)前后通過檢驗(yàn)樣品的吸收光譜檢驗(yàn)樣品的穩(wěn)定性.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1(a-g)為MbNO在不同激光功率密度下獲得的納秒瞬態(tài)拉曼光譜,圖1h為MbNO光解產(chǎn)物DeoxyMb的拉曼光譜.圖中獲得的DeoxyMb的穩(wěn)態(tài)拉曼光譜與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[32]完全一致.在MbNO各激光功率密度下的瞬態(tài)拉曼光譜中,我們既檢測(cè)到了六配位MbNO的特征拉曼振動(dòng)ν4(1377 cm-1)又檢測(cè)到了五配位光解產(chǎn)物DeoxyMb的特征拉曼振動(dòng)ν4(1358 cm-1),且隨著照射激光功率密度的增大光解產(chǎn)物DeoxyMb所占比例明顯增加.

圖1 不同激光功率密度(F)下MbNO的納秒瞬態(tài)拉曼光譜圖(a-g)和DeoxyMb的拉曼光譜圖(h)Fig.1 Nanosecond transient Raman spectra of MbNO at different laser fluxes(F)(a-g)and Raman spectrum of DeoxyMb(h)10-8F/(W·cm-2):(a)0.38,(b)0.76,(c)1.14,(d)1.52,(e)1.90, (f)2.28,(g)2.66

圖2 不同時(shí)間延遲下MbNO的皮秒時(shí)間分辨拉曼光譜圖Fig.2 Picosecond time-resolved Raman spectra of MbNO at different time delayspump photolysis wavelength:540 nm, Raman probe wavelength:407 nm

圖3 利用1377 cm-1振動(dòng)峰強(qiáng)度(I)表示MbNO體系中DeoxyMb和NO結(jié)合的動(dòng)力學(xué)曲線Fig.3 Rebinding kinetics between DeoxyMb and NO in MbNO by monitoring the peak intensity(I)at 1377 cm-1The adding error bars come from several measurements.

圖2為MbNO在不同時(shí)間延遲下的皮秒時(shí)間分辨拉曼光譜.由于受激光光解產(chǎn)率(實(shí)驗(yàn)條件下最大光解產(chǎn)率約為10%)的限制,我們?cè)诟鲿r(shí)間分辨拉曼光譜中并沒有明顯檢測(cè)到光解產(chǎn)物DeoxyMb的特征光譜.但是通過分析反應(yīng)物MbNO在不同延遲下的拉曼光譜,我們發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間延遲的改變,反應(yīng)物MbNO的特征振動(dòng)峰(ν4,1377 cm-1)強(qiáng)度有著明顯的改變,如圖3所示.

圖4為利用時(shí)間分辨吸收實(shí)驗(yàn)獲得的DeoxyMb與NO結(jié)合的動(dòng)力學(xué)曲線,其中N(t)表示t時(shí)刻光解產(chǎn)物的剩余百分?jǐn)?shù),空心圓圈為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)點(diǎn),實(shí)線為三指數(shù)衰減函數(shù)擬合曲線,擬合獲得的所有參數(shù)(見表1)與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果[8,10,12,13,15-17,21]吻合較好.

圖4 利用皮秒時(shí)間分辨吸收測(cè)得MbNO中DeoxyMb與NO結(jié)合的動(dòng)力學(xué)曲線Fig.4 Rebinding kinetics curves between DeoxyMb and NO in MbNO measured by picosecond timeresolved absorptionThe circles are experimental data,the solid line is the fitting result with three-exponential decay function.N(t)is the survival fraction of DeoxyMb at time t.In the figure,all the data have been normalized to 1 at 3 ps.

表1 三指數(shù)衰減函數(shù)模擬參數(shù)Table 1 Fitting parameters with three-exponential decay function

3 數(shù)據(jù)分析及討論

納秒瞬態(tài)拉曼光譜技術(shù)是一個(gè)多光子激發(fā)的過程,即一個(gè)脈沖中的光子數(shù)遠(yuǎn)大于聚焦區(qū)域中樣品的分子數(shù).本實(shí)驗(yàn)中,我們所用激光的脈沖寬度為7 ns.由于MbNO光解后DeoxyMb與NO的孿生結(jié)合速度很快,在幾百個(gè)皮秒內(nèi)結(jié)合幅度就達(dá)到95%以上,因此在圖1所有瞬態(tài)拉曼光譜中,我們既探測(cè)到了光解后五配位產(chǎn)物DeoxyMb的特征振動(dòng)峰(1358 cm-1),又探測(cè)到了反應(yīng)物MbNO的特征振動(dòng)峰(1377 cm-1),這充分說明了在一個(gè)激光脈沖中同一MbNO分子被激發(fā)了很多次.利用公式(1)[35]可以計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)同一MbNO分子被激發(fā)的次數(shù),即MbNO的激發(fā)速率(k),

其中F為入射激光的功率密度(W·cm-2),x為樣品MbNO的吸收效率,σ為MbNO分子在激光激發(fā)波長(zhǎng)處的吸收截面(cm2),Ephoton為入射激光單個(gè)光子的能量(J·photon-1).并進(jìn)而由公式(2)計(jì)算出MbNO分子相鄰兩次激發(fā)的時(shí)間間隔.

實(shí)驗(yàn)條件下,σ435nm(MbNO)=8.15×10-17cm2,Ephotoh(435 nm)=4.57×10-19J·photon-1,x=0.71,由此可以計(jì)算出不同入射激光功率密度下MbNO分子相鄰兩次激發(fā)的時(shí)間間隔,見表2.

表2結(jié)果表明,隨著激光功率密度的增大, MbNO分子相鄰兩次激發(fā)的時(shí)間間隔變小.這表明激光功率密度越大,與單個(gè)MbNO分子相互作用的光子數(shù)越多,同一個(gè)MbNO分子被激發(fā)的次數(shù)也就越多,即同一MbNO分子相鄰兩次激發(fā)的時(shí)間間隔就越短.由于MbNO光解后生成的五配位產(chǎn)物DeoxyMb很快會(huì)與解離的NO分子發(fā)生孿生結(jié)合,因此激發(fā)時(shí)間間隔越短,產(chǎn)物DeoxyMb的量相對(duì)于反應(yīng)物MbNO的比例就越高.產(chǎn)物DeoxyMb與反應(yīng)物MbNO量的比例大小可以利用圖1中1358與1377 cm-1振動(dòng)峰的強(qiáng)度比值表示.若將1358與1377 cm-1振動(dòng)峰的強(qiáng)度比值對(duì)相應(yīng)激發(fā)時(shí)間間隔作圖,可得圖5.由于相鄰兩次激發(fā)的時(shí)間間隔可以近似看成樣品被一次激發(fā)和一次探測(cè),因此相鄰兩次激發(fā)的時(shí)間間隔等同于時(shí)間分辨拉曼光譜技術(shù)中泵浦與探測(cè)之間的時(shí)間延遲,所以圖5中的曲線與圖4中的曲線呈現(xiàn)出很大的相似性.

表2 不同入射激光功率密度(F)下單個(gè)MbNO分子相鄰兩次激發(fā)的時(shí)間間隔(t)Table 2 Excitation time intervals(t)of a single MbNO at different laser fluxes(F)

圖5 MbNO納秒瞬態(tài)拉曼光譜中1358與1377 cm-1的峰強(qiáng)度比與激發(fā)時(shí)間間隔的關(guān)系Fig.5 Relationship between the peak intensity ratio of 1358 and 1377 cm-1in the nanosecond transient Raman spectrum of MbNO and the excitation time interval

圖6 納秒瞬態(tài)拉曼、皮秒時(shí)間分辨拉曼和皮秒時(shí)間分辨吸收實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比Fig.6 Comparison results on nanosecond transient Raman,picosecond time-resolved Raman,and picosecond time-resolved absorptionIn the figure,all the data have been normalized to 1 at 30 ps.

綜上,我們利用皮秒時(shí)間分辨拉曼(圖3)、皮秒時(shí)間分辨吸收(圖4)和納秒瞬態(tài)拉曼(圖5)三種實(shí)驗(yàn)手段分別測(cè)得了MbNO體系中DeoxyMb與NO結(jié)合的動(dòng)力學(xué)行為.其中圖3為通過檢測(cè)反應(yīng)物MbNO的變化來表征,圖4為通過檢測(cè)產(chǎn)物DeoxyMb的變化來表征,而圖5為通過檢測(cè)不同激光功率密度下產(chǎn)物DeoxyMb與反應(yīng)物MbNO的相對(duì)比值的改變來表征.雖然三種實(shí)驗(yàn)手段測(cè)定方法不同,但它們測(cè)定的同為MbNO分子光解后DeoxyMb與NO結(jié)合的動(dòng)力學(xué)過程.若將圖3、圖4和圖5作一對(duì)比,應(yīng)該獲得相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.圖6為三種實(shí)驗(yàn)結(jié)果的對(duì)比圖,圖中的所有數(shù)據(jù)都?xì)w一于30 ps處.通過對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)三種實(shí)驗(yàn)技術(shù)給出了非常相近的結(jié)合動(dòng)力學(xué)曲線,這說明我們同樣可以利用較為簡(jiǎn)單的納秒瞬態(tài)拉曼光譜技術(shù),通過改變激光照射于樣品的強(qiáng)度來研究MbNO體系中光解后DeoxyMb與NO結(jié)合的動(dòng)力學(xué)過程.該實(shí)驗(yàn)的有效性同樣為研究其它化學(xué)或生物中復(fù)雜體系的結(jié)合動(dòng)力學(xué)過程提供了一種新思路.

4 結(jié) 論

通過改變激光功率獲得MbNO分子在不同激光功率下的瞬態(tài)拉曼光譜.通過分析光解產(chǎn)物DeoxyMb和反應(yīng)物MbNO的ν4特征振動(dòng)峰強(qiáng)度比值與照射于樣品的激光功率即單個(gè)分子激發(fā)時(shí)間間隔的關(guān)系,獲得了與傳統(tǒng)時(shí)間分辨吸收和時(shí)間分辨拉曼光譜實(shí)驗(yàn)相一致的DeoxyMb與NO的結(jié)合動(dòng)力學(xué)行為.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用較為簡(jiǎn)單的納秒瞬態(tài)拉曼光譜技術(shù)同樣可以研究MbNO體系中DeoxyMb與NO超快結(jié)合過程.該實(shí)驗(yàn)的成功為人們研究其它化學(xué)或生物中復(fù)雜體系的超快結(jié)合動(dòng)力學(xué)過程提供了一種新思路.

1 Theorell,H.BioChem.Z,1934,268:73

2 Frauenfelder,H.;McMahon,B.H.;Austin,R.H.;Chu,K.;Groves, J.T.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2001,98:2370

3 Wittenberg,J.B.;Wittenberg,B.A.J.Exp.Biol.,2003,206:2011

4 Frauenfelder,H.;McMahon,B.H.;Fenimore,P.W.Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.,2003,100:8615

5 Parak,F.G.;Nienhaus,G.U.ChemPhysChem,2002,3:249

6 Springer,B.A.;Sligar,S.G.;Olson,J.S.;Phillips,G.N.Chem. Rev.,1994,94:699

7 Olson,J.S.;Phillips Jr.,G.N.J.Biol.Chem.,1996,271:17593

8 Petrich,J.W.;Lambry,J.C.;Kuczera,K.;Karplus,M.;Poyart,C.; Martin,J.L.Biochemistry,1991,30:3975

9 Ikeda-Saito,M.;Dou,Y.;Yonetani,T.;Olson,J.S.;Li,T.;Regan, R.;Gibson,Q.H.J.Biol.Chem.,1993,268:6855

10 Ionascu,D.;Gruia,F.;Ye,X.;Yu,A.C.;Rosca,F.;Beck,C.; Demidov,A.;Olson,J.S.;Champion,P.M.J.Am.Chem.Soc., 2005,127:16921

11 Meuwly,M.;Becker,O.M.;Stote,R.;Karplus,M.Biophys. Chem.,2002,98:183

12 Ye,X.;Demidov,A.;Champion,P.M.J.Am.Chem.Soc.,2002, 124:5914

13 Ye,X.;Yu,A.C.;Champion,P.M.J.Am.Chem.Soc.,2006,128: 1444

14 Carver,T.E.;Rohlfs,R.J.;Olson,J.S.;Gibson,Q.H.;Blackmore, R.S.;Springer,B.A.;Sligar,S.G.J.Biol.Chem.,1990,265:2007

15 Kholodenko,Y.;Gooding,E.A.;Dou,Y.;Ikeda-Saito,M.; Hochstrasser,R.M.Biochemistry,1999,38:5918

16 Kim,S.;Lim,M.J.Phys.Chem.B,2004,108:20366

17 Shreve,A.P.;Franzen,S.;Simpson,M.C.;Dyer,R.B.J.Phys. Chem.B,1999,103:7969

18 Tian,W.D.;Sage,J.T.;Srajer,V.;Champion,P.M.Phys.Rev. Lett.,1992,68:408

19 Austin,R.H.;Beeson,K.W.;Eisenstein,L.;Frauenfelder,H.; Gunsalus,I.C.Biochemistry,1975,14:5355

20 Schotte,F.;Lim,M.;Jackson,T.A.;Smirnov,A.V.;Soman,J.; Olson,J.S.;Phillips Jr.,G.N.;Wulff,M.;Anfinrud,P.A.Science, 2003,300:1944

21 Walda,K.N.;Liu,X.Y.;Sharma,V.S.;Magde,D.Biochemistry, 1994,33:2198

22 Yu,A.C.;Ye,X.;Ionascu,D.;Cao,W.X.;Champion,P.M.Rev. Sci.Instrum.,2005,76:114301

23 Wang,Y.;Baskin,J.S.;Xia,T.;Zewail,A.H.Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.,2004,101:18000

24 Franzen,S.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2002,99:16754

25 Harvey,J.N.Faraday Discuss.,2004,127:165

26 Alden,R.G.;Ondrias,M.R.J.Phys.Chem.,1990,94:85

27 Agmon,N.;Hopfield,J.J.J.Chem.Phys.,1983,79:2042

28 Strickland,N.;Harvey,J.N.J.Phys.Chem.B,2007,111:841

29 Zhang,Z.Y.;Benabbas,A.;Ye,X.;Yu,A.C.;Champion,P.M. J.Phys.Chem.B,2009,113:10923

30 Uchida,T.;Kitagawa,T.Acc.Chem.Res.,2005,38:662

31 Schoonover,J.R.;Strouse,G.F.Chem.Rev.,1998,98:1335

32 Mizutani,Y.;Kitagawa,T.Chem.Rec.,2001,1:258

33 Cianetti,S.;Negrerie,M.;Vos,M.H.;Martin,J.L.;Kruglik,S.G. J.Am.Chem.Soc.,2004,126:13932

34 Li,P.;Sage,J.T.;Champion,P.M.J.Chem.Phys.,1992,97: 3214

35 Loparo,J.J.;Cheatum,C.M.;Ondrias,M.R.;Simpson,M.C. Chem.Phys.,2003,286:353

36 Simpson,M.C.;Peterson,E.S.;Shannon,C.F.;Eads,D.D.; Friedman,J.M.;Cheatum,C.M.;Ondrias,M.R.J.Am.Chem. Soc.,1997,119:5110

September 14,2009;Revised:October 27,2009;Published on Web:November 25,2009.

Recombination Process between Myoglobin and NO Studied by Time-Resolved Raman Spectroscopy

LI Tao Lü Rong YU An-Chi*
(Department of Chemistry,Renmin University of China,Beijing 100872,P.R.China)

Nanosecond transient Raman spectroscopy is a widely used technique to investigate ultrafast structural dynamics in molecules.We studied the rebinding kinetics between deoxymyoglobin(DeoxyMb)and NO using nanosecond transient Raman spectroscopy.By monitoring the ratio between the intensity of the ν4vibrational mode in thephotoproduct(DeoxyMb)andinthereactant(MbNO)atdifferentincidentlaserfluxes,weobtainedtherecombination kinetics between DeoxyMb and NO in MbNO.For comparison,the kinetics of NO rebinding to DeoxyMb in MbNO was also studied using picosecond time-resolved Raman and absorption experiments.The kinetics results obtained with nanosecond transient Raman were consistent with those obtained by picosecond time-resolved Raman and absorption experiments.

Nanosecond transient Raman;Picosecond time-resolved Raman;Picosecond time-resolved absorption;Myoglobin;NO;Recombination

O643

*Corresponding author.Email:a.yu@chem.ruc.edu.cn;Tel:+86-10-62514601.

The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(20603047,20733001).

國(guó)家自然科學(xué)基金(20603047,20733001)資助項(xiàng)目