IGF-II在原核生物中的表達＊

王慶忠,任科云

(濰坊學院,山東 濰坊 261061)

IGF-II在原核生物中的表達＊

王慶忠,任科云

(濰坊學院,山東 濰坊 261061)

胰島素生長因子IGF-Ⅰ和 IGF-Ⅱ在機體的許多組織中都有表達,具有促進細胞生長和分裂等的多種生物學功能。在本研究中,我們采用RT-PCR法克隆和擴增到了IGF-Ⅱ基因,通過雙酶切、膠回收純化、連接后得到了p ET21b-IGF-Ⅱ重組質粒載體,然后將其轉化DH5α中,經IPTG誘導后表達的重組蛋白經純化,并用Western blot檢測,顯示重組質粒p ET21b-IGF-Ⅱ編碼一個約25kD的外源蛋白。

IGF-Ⅱ;RT-PCR;原核表達載體;表達

胰島素樣生長因子(insulin-like grow th factors,IGFs)是一類既有細胞分化和增殖活性,又有胰島素樣作用的多肽,包括IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ兩種。IGF-Ⅱ也被稱為生長調節素A(somatomedio A)。是Dechiara T M等發現的第一個內源性印跡基因表達產生的生長因子[1]。IGF2為單鏈多肽,分子量7.5ku,有A、B、C、D四個區域[2-3]。IGFs在結構和功能上與胰島素相似,具有促進細胞有絲分裂的生物學功能,對細胞的生長與分化起重要的調節作用,機體的許多組織器官都有IGFs的表達[4]。最近又發現IGF-Ⅱ能刺激神經及肌肉再生,是目前生物、醫學領域研究的熱點。由于天然IGF-Ⅱ的分離困難,阻礙了研究的深入。因此,我們利用基因工程方法克隆IGF-Ⅱ基因,構建原核表達載體,并在原核細胞中表達IGF-Ⅱ因子,為其調控機制研究以及它的應用打下基礎。

1 實驗材料

ICR小鼠購自濰坊醫學院實驗動物中心。

菌株為DH5α和BL21(DE3)。質粒為p GEM-T vector(Promega)和p ET21b vector(Novagen)主要化學試劑及耗材包括 TRlzol Reagent(Invitrogen)、Ribonuclease Inhibito r(aKaRa Biotech)、限制性內切酶(TaKaRa Biotech)、LA Taq DNA polymerase(TaKaRa Biotech)、M-MLV(Invitrogen life technologies)、T4 DNA Ligase(Promega)、凝膠回收試劑盒和質粒回收試劑盒(天為時代)、低分子量蛋白M arker (上海生科院研制)等。

2 研究方法

2.1 引物設計與合成

以p rimer 5.0軟件設計引物,并用verto r N TI 9.0進行分析。引物序列如下:

Sense p rime:5’-GCGAA TTCGCCCGCTGTTCGGTT-3’

Anti-sense p rime:5’-CGGAA TTCGAGGA GGTCACAGA TTG-3’

正向引物和反向引物中同時引入了EcoR I酶切位點。引物由上海生工合成。克隆基因的測序由上海博亞(三博遠志)完成。

2.2 組織總RNA的提取

(1)取小鼠心臟組織200mg,放到勻漿器中,加1m lTrizol試劑研磨。

(2)轉至DEPC水處理管,然后以每1m lTrizol加入0.2m l的比例加入氯仿,蓋緊離心管,用手劇烈震蕩離心管15秒,室溫放置5min。

(3)4℃下12000g離心5m in。

(4)取上層水相于一新的離心管,按每1m lTrizol加入0.5m l的比例加入異丙醇,室溫放置10min,4℃下12000g離心15min。

(5)棄去上清液,按每1m lTrizol加入1m l的比例加入75%乙醇(用DEPC水現配),渦旋混勻,4℃下7500g離心5min。

(6)小心棄去上清液,然后室溫或真空干燥5-10min,注意不要干燥過分,否則會降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于20-40ulDEPC水中,必要時可55-60℃水溶10分鐘,70℃保存。

2.3 RT-PCR克隆IGF-Ⅱ基因

反轉錄酶是M-MLV,反應體系如下:

總RNA 5.0μl(2.0μg)

Oligo(d T)18 1.0μl

M-MLV 5×buffer 8.0μl

dN TP(10mM) 2.0μl

M-MLV 2.0μl(200U/μl)

RNasin 1.0μl

DEPC水 1μl

混勻后,瞬間離心10秒。置42℃作用60min,然后置70℃10min以終止反應。取上述模板DNA(反轉錄產物)1μl,加入Ep管中,PCR反應體系如下:

dd H 2O 13.5μl

10×RNA PCR Buffer 2μl

4×dN TP混合物(2.5mM) 1μl

有義引物 1μl

反義引物 1μl

模板 1μl

TaqDNA聚合酶 0.5μl

混勻后,瞬時離心。PCR參數設定為:94℃預變性4 min;然后是94℃變性1 m in、55℃復發45sec、72℃延伸1 min,共30循環;最后是72℃延伸10 min。

2.4 電泳回收DNA與連接到T載體

PCR產物經瓊脂糖電泳后加以回收。回收操作按試劑盒說明書進行。然后將回收的產物連接到 T載體,連接反應按T-Vecto r使用說明進行,體系10μl,混勻15℃連接16個小時。

2.5 大腸桿菌感受態細胞的轉化與篩選

常規方法轉化和進行藍白斑篩選。

2.6 測序

分別挑取6-8個陽性菌落,接種到LB培養中培養,然后提取質粒,電泳檢測后,送公司測序。

2.7 構建原核表達載體

分別取5μl測序結果中序列正確的質粒和5μlp ET21b表達質粒載體,分別加1μl內切酶切緩沖液, EcoRⅠ酶1μl,無菌水補至總體積10μl,37℃保溫1.5h。然后,通過瓊脂糖產凝膠電泳檢測酶切結果,并回收酶切產物。連接體系同前,連接完畢后,轉化BL21(DE3)感受態細菌,并篩選陽性菌落和進行PCR擴增鑒定。

2.8 IPTG誘導表達與Western blo t檢測

先將含IGF-II基因的表達菌株在LB培養基中預培養過夜。

100m lTM培養基加入100μl50m g/m LAM P,使終濃度達50μg/m l;然后按1/50-1/100比例加入過夜培養的上述菌液,于37℃恒溫搖床250r/m in培養3h左右,使其 OD600值達0.7-0.8。再加入50μl1ol/L IPTG,使終濃度達0.5mmol/l,進行外源基因的誘導表達。于37℃恒溫搖床250r/min,繼續培養4-5h后,4℃低溫離心收集菌體,棄上清,裂解菌體,95℃變性菌體蛋白。取25μl上樣,進行SCSPA GE。

將電泳產物轉移至PVDF膜,5%無脂牛奶封閉1h,小鼠抗人IGF-Ⅱ單克隆抗體(1:500)4℃箱孵育1hr后,加入HRP一標記的二抗(1:1 000)室溫2 h,顯色并暴光于X線膠片。

3 結果

3.1 IGF-Ⅱ目的基因片段的RT-PCR結果與分析

小鼠的心臟組織mDNA為模板。用RT-PCR法,以olig(d T)引物反轉錄合成lGF-ⅡcDNA第一鏈,然后以合成的特異性引物和以cDNA為模板進行PCR擴增。反應產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示(圖1),擴增帶大小(664bp)與預期的的結果一致。

3.2 重組表達質粒的酶切與電泳鑒定

如圖2,泳道1為p ET21b-IGF-Ⅱ原核表達質粒經EcoRI酶切及擴增后,酶切片段與預期的一致,說明lGF-Ⅱ基因插入進了原核表達載體p ET21b中,泳道2為對照組,顯示空白質粒p ET21b酶切擴增后電泳結果。

圖1 PCR擴增的目的片斷大小注:1為Marker;2為PCR產物

圖2 重組p ET21b-c IGF-Ⅱ的酶切與電泳結果注:1為p ET21b-IGF-Ⅱ原核表達質粒經EcoRI酶切后電泳結果;2為空白質粒p ET21b酶切后電泳結果; 3為Marker。

圖3 誘導表達的重組蛋白的Western blot分析注:1為未誘導組(陰性對照);2與3為IPTG誘導4 h的實驗組。

3.3 Western blot分析

分別將未誘導表達的重組蛋白、兩組誘導表達4 h的重組蛋白進行Western blot反應,結果如圖3所示。兩組誘導表達的重組菌均有明顯的免疫印跡條帶出現,而作為陰性對照的未誘導組則無此條帶。

4 分析

在本實驗中,我們通過引物設計導入了酶切位點。在完成PCR之后,純化PCR產物,用限制性內切酶切割,而形成黏性末端[5]。再用同樣的內切酶切割質粒載體后進行連接,從而構建了含有IGF-Ⅱ外源片段的T-載體和p ET21b-IGF-Ⅱ原核表達質粒載體。

大腸桿菌表達系統是目前應用最為廣泛的經典表達系統。但許多外源蛋白在大腸桿菌內表達時,往往不能白發折疊生成有一定空間結構和特定生物功能的蛋白質,而是以一種不可溶的沉淀即包涵體的形式存在于胞內。雖然以包涵體形式表達具有易于純化、表達產物較穩定等優點,但位于包涵體中的重組蛋白往往缺乏生物話性,進一步的包涵體體外復性產率也低[6-7]。

重組質粒p ET21b-IGF-Ⅱ導入宿主菌,加IPTG誘導進行表達經IPTG誘導,以非融合形式表達了lGF-II。本研究克隆了IGF-II的基因并構建了原核表達系統,這為獲得大量IGF-II產品以便進一步研究IGF-II的生物學活性、作用機理及開發IGF2的臨床應用奠定了一定的基礎。

[1]DeChiara T M,Robertson E J,Efstratiadis A.Parental imp rinting of the mouse insulin-like grow th facto r IIgene[J]. Cell,1991,64:849-859.

[2]呂勇剛,陳蕤.胰島素樣生長因子-2研究進展[J].中國醫學文摘:腫瘤學,2001,14(2):163-164.

[3]李瑗.胰島素樣生長因子-2與人及實驗動物的肝細胞癌[J].臨床與實驗病理學雜志,1998,14(5):500-501.

[4]高玉紅,李慶章.胰島素樣生長因子系統研究進展[J].中國乳品工業,2006,34(4):46-49.

[5]吳嵐曉,李明,王萍,等.人胰島素樣生長因子-1在大腸桿菌中的表達[J].藥物生物技術,2001,8(4):185-188.

[6]曾凡星,楊錫讓,楊則宜.人胰島素樣生長因子的研究進展[J].北京體育大學學報,1998,21(3):42-45.

[7]岳鳳鳴,趙煥英.人胰島素樣生長固子-1基因的克隆、表達和活性檢測[J].解剖學報,2003,34(3):307-311.

(責任編輯:劉乃生)

IGF-IIExpressed in Prokaryotic Organ ism

WANG Qing-zhong,REN Ke-yun
(Weifang Un iversity,Werfang 261061,China)

IGF-Ⅰand IGF-Ⅱare exp ressed in many organs,and have important roles in cell grow th and p roliferation.In this study,we,the target gene,IGF-Ⅱ,was cloned and amp lified By RT-PCR method from cardiac m uscle and then inserted into T-vecto r,and then inserted the exp ression vecter p ET21b.The recom binant vecto r w as indicated exp ressing IGF-Ⅱp rotein in E.coli DH5αafter induced by IPTG.We then purified reeombinant p rotein and analyzed via Western blot.

IGF-Ⅱ,RT-PCR,p rokaryotic exp ression vector,exp ression

2010-09-22

王慶忠(1961-),男,山東青州人,濰坊學院生物工程學院教授,博士。

R394 文獻標識碼:A 文章編號:1671-4288(2010)06-0103-03