海濱錦葵莖尖組織培養再生體系的優化

劉 野,李 群,李 賀,阮成江

(1.遼寧師范大學生命科學學院,遼寧大連 116029;2.大連民族學院生物技術與資源利用國家民委教育部重點實驗室,遼寧大連 116605;3.沈陽農業大學生物科學技術學院,沈陽 100161)

海濱錦葵莖尖組織培養再生體系的優化

劉 野1,2,李 群3,李 賀2,阮成江2

(1.遼寧師范大學生命科學學院,遼寧大連 116029;2.大連民族學院生物技術與資源利用國家民委教育部重點實驗室,遼寧大連 116605;3.沈陽農業大學生物科學技術學院,沈陽 100161)

以莖尖為外植體,對海濱錦葵 (Kosteletzkya virginica)再生體系的優化進行了研究,結果表明:莖尖萌發的最適培養基為MS+ IAA0.3 mg·L-1+ZT0.3 mg·L-1,萌發率為 91.11%;繼代增殖最適培養基為 MS+ IAA0.1 mg·L-1+KT0.5 mg·L-1,增殖系數為 4.67;生根培養基為MS(蔗糖 3%、瓊脂 0.6%、pH值 5.8),生根率為 90%。煉苗移栽后,成活率可達 60%。

海濱錦葵;莖尖;組織培養;植株再生

海濱錦葵 (Kosteletzkya virginica)為錦葵科多年生草本植物,自然分布于美國含鹽沼澤地帶,1992年作為發展鹽土農業的鹽生植物從美國引進中國,已在山東、遼寧、江蘇等沿海灘涂試種成功,是一種優良的耐鹽油料植物[1],油脂含量與重要的經濟作物大豆不相上下[2],作為生物柴油原料[3-4],具有很大的發展潛力。為進一步提高其種子中油脂的含量,使其成為理想的生物柴油原料,可通過轉基因育種來進行遺傳改良,而建立高效的植株再生體系則是轉基因育種成功的前提條件之一[5]。本實驗以海濱錦葵莖尖為外植體,在不同的培養基上進行莖尖萌發誘導、芽的繼代增殖以及植株再生培養,以期獲得高頻再生體系。

1 材料與方法

1.1 材料

海濱錦葵種子于 2008年秋采自大連民族學院海濱錦葵試驗地。

1.2 方法

1.2.1 無菌材料的獲得

海濱錦葵莖尖取自 3日齡的無菌苗,用鑷子和解剖刀除去子葉,以充分暴露被幼葉包裹著的莖尖分生組織 (顯微鏡下呈白色半透明圓錐狀)[6],切除莖尖頂端的生長點后取 0.5～1.0 mm的莖尖,用于離體培養。

1.2.2 培養方法

以 MS(蔗糖 3%、瓊脂 0.8%、pH值 5.8)[7]培養基為基本培養基,附加不同濃度的 IAA,ZT,KT,6-BA先誘導莖尖萌發,再進行繼代增殖,之后將高約 2.5～3 cm的增殖苗轉移到不加任何激素的MS培養基上,誘導生根。激素類物質均過濾滅菌,在基本培養基高溫高壓滅菌后加入[7]。

1.2.3 培養條件

培養溫度:(26±1)℃;相對濕度:70%～80%;光照:14 h·d-1;光強:2 000lx[7]

1.2.4 煉苗移栽

當幼苗的根長到 2 cm左右時去除封口膜,在室內自然光下煉苗 3 d。然后取出并漂洗黏附于根上的培養基和松散的愈傷組織,立即移植到含水量 60%的營養土 (V(腐殖土)∶V(珍珠巖)=3∶1)中,并保持營養土表面濕潤[7]。培養 5 d左右移入花盆并轉至室外培養,15 d后統計成活率。

1.2.5 計算方法

萌發率 =(萌發生長的外植體數 /接種外植體數)×100%;

褐化率 =(褐化的外植體數/接種外植體數)×100%;

增殖系數 =(增殖芽數 /接種芽數)×100%;

生根率 =(生根苗數 /接種的苗數)×100%;

成活率 =(成活苗/移栽的組培苗總數)×100%。

2 結果與分析

2.1 接種發芽率

海濱錦葵的莖尖接種到附加不同濃度的I

AA,KT,ZT和 6-BA培養基上誘導萌發,5～8 d莖尖分生組織開始萌動 (如圖 1、圖 2),其中有的在基部形成愈傷組織,有的芽開始伸長,隨后芽生長速度加快。誘導 15 d結果顯示 (見表 1),5種培養基對莖尖的萌發有極顯著差異 (F=50.75,P＜0.01)。第二種處理對莖尖的萌發效果最好,萌發率為 91.11%。

圖 1 萌動的莖尖

圖 2 誘導 15 d后萌發的莖尖

表 1 IAA,KT,ZT與 6-BA對海濱錦葵莖尖誘導分化的影響

2.2 繼代增殖培養及植株再生

繼代增殖 15 d后統計芽增殖情況 (如圖 3),結果表明,第一種處理對芽誘導效果最好,增殖系數為 4.67(見表 2),生長旺盛且多為 3個以上叢生芽。生根培養 10 d左右可產生不定根,15 d后生根率為 90%,小苗生根速度快,莖粗壯,葉片生長旺盛,根系非常發達 (如圖 4)。煉苗移栽時要注意保持營養土表面濕潤,控制室內濕度在 70%～80%,溫度在 25℃左右,培養 5 d后移栽入花盆[7],轉至室外培養。統計幼苗成活率為 60%(如圖 5)。

表 2 IAA,KT,ZT與 6-BA對海濱錦葵莖尖繼代增殖的影響

圖 3 芽的增殖

圖 4 生根培養基上的生根情況

圖 5 再生植株

3 討 論

莖尖萌發的過程中出現了不同程度的褐化現象,可以在培養基中添加一些抗氧化物質,如添加PVP[8]、活性炭[9]來解決褐化問題。海濱錦葵組織培養過程中的重點和難點是芽的繼代增殖。外植體的選擇、激素的選擇尤其是細胞分裂素的選擇都是至關重要的。本實驗選取苗高 2.5～3.0 cm,芽粗壯,長有真葉且顏色嫩綠的莖尖進行繼代增殖,取得了較好的效果。Cook等[10]、鄭熙等[7]和郭予琦等[11]分別使用 1.0 mg·L-1NAA和 10 mg·L-12-iP、0.1 mg·L-1IAA和 0.5 mg·L-1L ZT、1.0 mg·L-1NAA和 10 mg·L-12-iP組合成功的誘導出海濱錦葵不同部位的愈傷組織不定芽;郭予琦等[11]在實驗中指出,KT對誘導海濱錦葵莖段愈傷組織不定芽的作用極弱;但是張寶紅等[12]在棉花莖尖分生組織培養實驗中指出,KT的添加對芽的增殖和生長是有利的,棉花和海濱錦葵同屬于錦葵科植物。本實驗以海濱錦葵莖尖為外植體 ,利用 0.1 mg·L-1IAA、0.5 mg·L-1KT組合,芽的增殖系數達到了 4.67,首先表明了相同的激素對不同的外植體的作用效果不同;其次表明當細胞分裂素與生長素濃度比例處于較高水平時有利于芽的增殖[13],細胞分裂素在誘導芽的增殖時起主導作用[14]。鄭熙等[7]、郭予琦等[11]和Cook等[10]的植株再生實驗整個周期分別用了約130,120,93 d,而本實驗只用了 65 d,從很大程度上縮短了海濱錦葵植株再生的周期。

4 結 語

本實驗以海濱錦葵莖尖為外植體進行植株再生,莖尖萌發最適培養基為MS+ IAA0.3 mg·L-1+ZT0.3 mg·L-1,萌發率為 91.11%;繼代增殖最適培養基為 MS+ IAA0.1 mg·L-1+KT0.5 mg·L-1,增殖系數為 4.67;生根培養基為 MS(蔗糖 3%、瓊脂 0.6%、pH值 5.8),生根率為 90%。并進行了溫室煉苗與移栽等技術研究,幼苗成活率達到 60%。實驗過程成功地優化了海濱錦葵莖尖組織培養再生體系,對進一步利用轉基因方法培育海濱錦葵優良新品系具有重要的意義。

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Optim ization of Tissue Culture Regeneration System ofM eristem ofKosteletzkya virginica

L IU Ye1,2,L I Qun3,L I He2,RUAN Cheng-j iang2
(1.College ofLife Science,LiaoningNormalUniversity,Dalian Liaoning 116029,China;2.KeyLaboratory ofBiotechnology&Bio-ResourcesUtilization,State Ethnic Affairs Commission andMinistry of Education,Dalian NationalitiesUniversity,Dalian Liaoning 116605,China;3.College ofBiological Science and Technology,ShenyangAgriculturalUniversity,ShenyangLiaoning 100161,China)

We studied optimization of the regeneration system ofKosteletzkya virginicausingmeristem as the explant.The results showed thatMS+ IAA0.3 mg·L-1+ZT0.3 mg·L-1was the best culture medium for ger mination with a germination rate of 91.11%;the best subculture medium wasMS+ IAA0.1 mg·L-1+ZT0.5 mg·L-1,with a multiplication factor of 4.67;the bestmedium for rootingwasMS(sucrose at3%,agar at0.6%and pH at 5.8)with a 90%rooting rate.The survival rate of hardened-off seedlingswas up to 60%after being transplanted.

Kosteletzkya virginica;meristem;tissue culture;plant regeneration

Q943.1

A

1009-315X(2010)01-0009-04

2009-10-25

國家“十一五”科技支撐計劃重大項目子專題 (2006BAD09A04);中國博士后科學基金特別資助項目(200801371);中國博士后科學基金資助項目 (20070420990);江蘇省博士后基金資助項目 (0702018C)。

劉野 (1981-),男,遼寧興城人,遼寧師范大學生命科學學院碩士研究生,主要從事植物生物技術研究。

阮成江 (1972-),男,河南新縣人,教授,博士,學校優秀學科帶頭人,碩士生導師,主要從事植物進化適應和遺傳育種研究,E-mail:ruan@dlnu.edu.cn。

(責任編輯 鄒永紅)