論殺蟲劑穿透生物學與昆蟲抗藥性測定

摘要：本文闡明了殺蟲劑穿透生物學的基本概念及其對昆蟲抗藥性測定的指導意義，論述了殺蟲劑穿透生物學提出的背景及其與田間毒理學的關系，分析了在昆蟲抗藥性測定中存在的問題及其主要原因；提出了殺蟲劑穿透生物學在昆蟲抗藥性測定中的應用原則。

關鍵詞：殺蟲劑；穿透生物學；抗藥性測定

中圖分類號：S481.1；S482.3 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942(2010)10-0085-05

殺蟲劑穿透毒理是昆蟲毒理學重要的研究領域，因為殺蟲劑對昆蟲的穿透是其發揮毒殺效果的第一前提。現代有機合成的殺蟲劑大多具有一種以上進入昆蟲體內的途徑即作用方式，殺蟲劑的生物測定尤其是在室內活性篩選的過程中，一般是根據化合物本身所具有的作用方式而確定相應的測定方法，再根據試驗結果判斷化合物的生物活性。這種生物活性顯然只是一個初步的實驗室評估結論，如果要真正開發一個商品的殺蟲劑必須在田間條件下進行藥效的鑒定，也就是說最終考察一個化合物對某靶標昆蟲的生物活性必須由田間試驗予以確定。這是因為殺蟲劑的使用總是在田間環境下進行，其藥效受到實際的用藥方式、藥劑穿透形式、環境條件以及靶標昆蟲的生物學行為的綜合影響，因而與實驗室測定的結果不完全吻合，有時甚至可能完全相反。

昆蟲抗藥性是在田間用藥條件下有害昆蟲形成的一種適應性變化，其形成速度和機制受制于藥劑進入昆蟲體內的穿透行為。目前國內外關于昆蟲抗藥性的研究與測定很少考慮田間條件藥劑的穿透行為的影響。弄清楚兩者間的關系對于正確理解昆蟲抗藥性的形成及其測定方法具有重要的理論和實踐意義。

殺蟲劑穿透生物學就是關于殺蟲劑在田間狀態下的穿透途徑及其速率與藥劑的物理狀態、昆蟲行為學習性及其環境條件之間關系的科學。該概念回答了三個問題，即作為抗性機理研究的供試材料均源于實驗室條件下藥劑特定脅迫穿透模式汰選的“人工”抗性種群，是否具有合理性，抗性測定方法的選擇需要遵循何種原則才能保證其測定結果最大限度地符合田間的實際抗性水平，實驗室測定時設定的條件如何真實地反映田間環境下的藥劑穿透速率的變化。提出該概念旨在強調抗性機制的研究及其抗性檢測必須充分考慮抗藥性與田間環境條件的聯系，尤其是與昆蟲在自然條件下的生物學行為的關系；抗性的測定或檢測方法必須建立在藥劑穿透生物學理論的基礎上才能還原昆蟲抗藥性發展的歷程及其形成機制。

1、殺蟲劑穿透生物學提出的背景及其理論淵源

害蟲對化學藥劑的抗藥性歷史不到100年，就已經有600多種害蟲對1種或多種藥劑產生了抗藥性，我國已有45種害蟲產生抗藥性，其中農業害蟲36種。昆蟲抗藥性的產生和發展是在化學藥劑的選擇壓力下昆蟲的表皮穿透性、生化代謝以及作用靶標變化的結果。抗藥性不僅導致化學防治的成本增加，也使農產品因有害生物危害的風險增加。

預測和評估害蟲的抗性及其風險是科學地制定抗性治理策略的前提和基礎。迄今為止昆蟲抗藥性檢測主要采用生物檢測法、神經電生理檢測法、生物化學檢測法、免疫學檢測法、分子生物學檢測法等。其中生物檢測法即生物測定法仍然是最經典、最基礎的方法，即根據藥劑作用方式和昆蟲種類建立標準的抗性檢測方法，使用該方法建立一個敏感種群的毒力基線，再以此為依據對田間種群的毒力進行比較，從而確定其抗性的變化及其程度。

1956年世界衛生組織召開了一系列的抗性測定方法的討論會，于1970年制定出標準的測定方法。聯合國糧農組織也在1969-1974年先后發表了測定原理及15種農藥抗性測定的試行方案。據此我國也制定了24種重要農業害蟲抗藥性測定標準方法和試行方法。但這些標準制定的依據均是昆蟲形態和藥劑作用方式，故對同一種害蟲一般推薦了一種以上的測試方法及與之相應的測定蟲齡。由于受到傳統的毒力測定“量化和精準”概念的束縛，國內外推薦的測定標準大多采用點滴法，就象蚜蟲這樣小型的昆蟲亦推薦點滴法。可以預期純室內測試方法(點滴法)得到的結果與田間實際情況的符合性必然較低。因為點滴法所用藥劑存在的物理狀態、藥劑對昆蟲的穿透方式與田間條件下存在著本質區別。點滴法是藥劑經過有機溶劑溶解后的溶液狀態下強制通過昆蟲的胸部背板進入，而田間條件下藥劑顯然是以水乳劑多半通過昆蟲體壁的其它部位尤其是跗節或者包括消化道在內的綜合穿透途徑進入。昆蟲生理學研究表明，昆蟲的跗節或前跗節與胸、腹部體壁的構造有很大差別，中腸與體壁的構造存在更大的差異”。這可能是導致許多研究結果與生產實踐不一致的主要原因。比如：依據實驗室測得的區分劑量在具體應用時總要設計一個所謂的“系數”，即便如此監測結果也不如使用藥劑田間推薦劑量所得到的結論更符合田間的抗藥性實際狀況；基于傳統研究方法關于抗性機制的研究認為穿透抗性只在極少條件下發生且并不是主要的抗性機理，而事實上在害蟲抗性治理中廣泛地使用了滲透劑的技術策略。此外，由于同種昆蟲或相同藥劑對同一種測試對象存在1種以上的測定標準，導致大量類似的研究結果無法相互比較，進而在很大程度上喪失了科學價值。

趙善歡在研究殺蟲劑的毒力與藥效的關系時，曾經提出“田間毒理學”的概念，指出在探討殺蟲劑田間的作用及實際藥效時，僅以分子生物學、分子毒理學為基礎來研究殺蟲劑對昆蟲個體生化、生理的影響及其作用機制是不夠的，還必須研究田間各種生態因素及昆蟲種群的結構與動態對殺蟲劑田間藥效的影響，并強調有些情況下殺蟲劑的毒力需要在田間條件下進行測定。顯然很多年前科學家已經注意到昆蟲毒理學的研究離不開田間條件下殺蟲劑對靶標害蟲種群生長發育的影響。只是因為昆蟲作為一種可以獨立于寄主生存的有機個體，以及實驗室研究條件的可控性等，昆蟲毒理學包括殺蟲劑抗藥性的研究未受到足夠的重視，以至于“田間毒理學”的概念并未受到廣泛的關注。重新評價“田間毒理學”的意義并在此基礎上闡明“殺蟲劑穿透生物學”的理論，對于指導昆蟲抗藥性研究的實踐是一件重要而且十分緊迫的任務。

2、從穿透生物學視角討論昆蟲抗藥性測定與防治效果間的關系

所有關于昆蟲抗藥性的標準方法包括WTO、FAO、IRAC以及國內推薦的重要衛生與農業害蟲的測定方法的制定依據均基于昆蟲的形態和藥劑的作用方式。由于現代有機合成殺蟲劑均具有良好的觸殺活性，且點滴法被公認為最具精確性和定量化的特點，故在國內外推薦用于農業害蟲抗性測定的標準中優先考慮了該法。但是這一方法所依據的原理以及藥劑的穿透方式恰恰與藥劑實際使用時的狀況差異最大。這就必然導致了抗性研究的結論往往與生產實踐不能完全吻合。事實上在很多情況下室內生物測定夸大了抗藥性的重要性。如用點滴法測定煙芽夜蛾對菊酯的抗藥性超過50倍，這與田間防效降低的情形沒有完全的關聯性；用于測定該蟲對滅多威的抗性指數高達850倍以上，而田間防效僅從64％下降到39％。吳益東等(1996)用點滴法和浸葉法測定棉鈴蟲對氯氰菊酯、滅多威和久效磷的抗藥性，結果表明點滴法測得對氯氰菊酯的抗性倍數為20.8-34.8倍，而浸葉法為2.0-18.7倍；點滴法測得對滅多威的抗性倍數為5.4-16.4倍，而浸葉法為1.4-6.5倍；點滴法測得對久效磷的抗性倍數為2.8-9.3倍，而浸葉法為11.3-70.1倍。可見，浸葉法中對氯氰菊酯和滅多威的抗性倍數，總是小于相應種群在點滴法中的抗性倍數；而浸葉法中對久效磷的抗性倍數總是大于相應種群在點滴法中對久效磷的抗性倍數。與田間防治效果相比較證明，浸葉法所測結果更符合當地棉鈴蟲田間抗性水平。說明不同的測定方法所得到的抗性結果存在較大差異，同一種測定方法應用不同的藥劑所得到的結果的符合性也存在明顯差異。產生這種差異可能源于不同藥劑的作用方式的差異以及兩種測定方法中所用藥劑的技術等級不同，即點滴法使用的是原藥而浸葉法使用的是制劑。但是，點滴法所測抗性水平從理論上說應該低于浸葉法，因為點滴法使用的藥劑是經過有機溶劑溶解后的稀釋液，應該更容易穿透昆蟲的體壁；同時在氯氰菊酯、滅多威和久效磷之間存在相反的關系，即測定方法與測定結果呈現較為復雜的關系。因而殺蟲劑穿透生物學的改變才是導致這些結果的最本質的原因。

實踐還證明，田間環境尤其是溫度會改變藥劑進入昆蟲體內的方式或者昆蟲自身的生理狀態。趙建周等(1996)利用田間推薦劑量作為區分劑量研究小菜蛾對啶蟲隆的抗藥性時發現，其抗藥性頻率的增加發生于6-10月，其它時期保持穩定，此變化與當地田間藥效的變化相一致。郭瑩等(2004)在研究小菜蛾對毒死蜱與溫度的關系時亦發現在10-30℃范圍內低溫飼養的小菜蛾對試驗藥劑更敏感。這說明溫度可能會改變藥劑的穿透行為，或者說昆蟲的抗藥性實際上是一個動態的變化過程，也就是說殺蟲劑穿透生物學還包括溫度等外部條件對藥劑穿透行為可能產生的影響。

一般來說，殺蟲劑噴灑在寄主植物上后進入昆蟲體內的途徑一般可區分為3種復合模式。(1)藥劑直接噴灑在昆蟲體上后，主要從昆蟲體壁或消化道進入。某些活動性較弱的種類如蚜蟲、螨類、蚧殼蟲等，藥劑多半是按此模式進入昆蟲體內；觸殺性較強的藥劑主要是通過體壁進入；兼具觸殺和內吸作用的藥劑可能通過昆蟲刺吸植物汁液而從消化道被攝入。(2)藥劑噴灑在寄主植物上后昆蟲在受藥表面爬行時，藥劑主要從昆蟲跗節或消化道進入。某些活動性較強的種類如夜蛾科昆蟲，藥劑一般很難直接噴灑到昆蟲體上，多半是通過它們在受藥表面爬行而攝入。對這些昆蟲的抗性測定如采取點滴法進行，所得結論一般很難符合實際情況。(3)藥劑施用后主要通過滲透作用到達昆蟲活動部位，通過昆蟲消化道或體壁進入昆蟲體內。鉆蛀性昆蟲如螟蟲、實蠅類幼蟲、潛葉蛾幼蟲等的受藥方式主要是通過這種模式。對這些昆蟲的抗性測定如采用點滴法則與實際情況相去更遠。事實上在國內外推薦的抗藥性測定標準中，后兩者模式恰恰首推的就是點滴法。基于殺蟲劑穿透生物學的理論，要使抗性測定的結果比較符合田間藥效的變化，必須盡可能模擬在田間條件下該藥劑對靶標害蟲的穿透模式，并在與大田相似的溫度條件下進行測定。比如，陳年春等采用點滴法、浸葉法和浸漬法測定擬除蟲菊酯和有機磷殺蟲劑對棉蚜的抗性，結果表明，浸葉法效果最好，重復性高，適應性好，毒力曲線的b值最高；對溴氰菊酯的抗性測定結果表明，點滴法比浸葉法更符合田間實際抗性水平，前者測得的LC₅₀為>50000 mg/L，后者僅256.5 mg/L，從而得出浸葉法更符合田間條件下藥劑對蚜蟲的穿透模式，再次證明了殺蟲劑穿透生物學對于抗性測定方法的重要指導意義。需要強調的是評價一個具體的生測標準是否具有適用性，最終必須考察其毒力曲線計算所得的區分劑量(LD₉₉)是否與田間防治效果具有一致性，這顯然過去未注意到。

3、殺蟲劑穿透生物學與抗性測定方法的關系

殺蟲劑穿透生物學的意義概括起來可以表現在兩方面：一是指導殺蟲劑應用時必須選擇最符合其穿透途徑的用藥方法和時間；二是指導抗性測定時其測定原理必須盡可能符合藥劑在田間狀態下一般的穿透模式。中華人民共和國農業部為國內殺蟲劑新品種登記的需要陸續制定了《農藥室內生物測定試驗準則——殺蟲劑》，其中推薦的方法包括點滴法、夾毒葉片法、錐形瓶法、連續浸液法、浸漬法、藥膜法、噴霧法、人工飼料混藥法、稻莖浸漬法、玻片浸漬法、浸葉法等。這些方法考慮到了殺蟲劑的大多數作用方式以及昆蟲的生物學習性對生物測定方法的要求，但未充分考慮田間條件下藥劑的穿透生物學行為。為此基于殺蟲劑穿透生物學的基本原理，對昆蟲抗藥性的測定或監測，需要建立一批更為科學和標準的試驗準則。具體來說，研究一個具體的測試對象的測定標準時應考慮以下原則。

①測試對象的生物學特性：昆蟲測試蟲態的活動特點如活動性強弱、晝夜節律等，取食習性如表面、潛葉或蛀莖取食等，口器類型如刺吸式、咀嚼式等。

②昆蟲主要危害世代的環境溫度：昆蟲生長發育的溫度會影響其對藥劑的敏感性，如在10-30℃的范圍內，低溫飼養的小菜蛾比高溫飼養的對藥劑更為敏感；趙建周等(1996)發現小菜蛾在年生活史中對殺蟲劑的敏感性變化呈現一定的節律性。因而，抗性測定時控制的溫濕度最好與實際情況相一致。

③藥劑的處理方式：藥劑的處理方式直接決定了藥劑的穿透途徑。如點滴法處理昆蟲時，藥劑只能局部地通過胸部背板進入昆蟲體內；藥膜法處理時，藥劑可以從昆蟲體壁的各部分進入；浸葉法和噴霧法處理時，藥劑可同時從體壁、消化道或氣門進入。顯然藥劑不同的穿透途徑到達作用靶標的難易和過程不同，穿透過程中藥劑的主要代謝方式亦不同，從而昆蟲的抗性機制也隨之不同。因此抗性測定過程中所采取的藥劑處理方式如果與田間實際情況相去太遠，所測結果就不能真實地反映昆蟲抗藥性的實際水平。這就是前面已經論述過的某些測定方式與實際情況完全不相符合的主要原因。

④藥劑的物理狀態：抗性測定是要確定某種藥劑使用一段時間后田間生物活性的變化情況，因此測定方法必須要與藥劑的穿透生物學特點相適應，也就是要最大可能地模擬藥劑實際的穿透模式。除處理方法外，還必須考慮藥劑使用時的物理狀態。對于田間主要的施藥方式——噴霧法而言，藥劑均是以水乳劑的形式存在，因此點滴法、藥膜法所用藥劑的物理狀態與田間情況下不一致。藥劑的物理狀態勢必直接影響其穿透途徑，這就是為什么大多數研究結果均證明浸葉法、噴霧法和浸漬法更適合抗性生物測定的主要原因。

⑤寄主植物的生物學特點：在殺蟲劑抗性測定過程中，寄主的生物學特點會間接影響到藥劑的測定結果。因為寄主植物的生物學特性會影響到藥液霧滴的沉降方式以及對藥劑的吸附性能，從而影響到藥劑對昆蟲體壁的穿透模式。如使用藥膜法測定昆蟲的抗性時，理論上來說藥劑對昆蟲的穿透模式與田間情形是相似的，但使用濾紙或玻璃瓶制作的藥膜與藥劑在寄主植物上形成的藥膜肯定是存在差別的。即使同在實驗室條件下，濾紙藥膜和玻璃瓶藥膜也有很多不同。比如藥劑的成膜方式、藥劑的吸附特點、昆蟲與藥膜的接觸形式等都可能存在較大的差異。寄主植物其表面的構造特點與濾紙或玻璃瓶更是完全不同，它們表面的蠟質構造以及其上的突起或者毛、刺等物理結構會直接影響到藥劑的吸附和釋放行為，昆蟲還會通過口器直接對寄主進行取食等生物學行為。這些均會導致藥劑的穿透模式出現較大差異從而影響到藥劑的毒力變化。此外藥劑在寄主植物表面的沉降方式與實驗室藥膜的制作情況也有較大差異。因此在抗性測定時必須引入寄主因素。這也是愈來愈多的研究者更傾向于使用浸葉法、噴霧法、葉碟法等進行殺蟲劑抗性測定的本質原因。

參考文獻：

[1]趙善歡，昆蟲毒理學[M]，北京：中國農業出版社，1993，9-29

[2]徐漢虹，植物化學保護學(第4版)[M]，北京：中國農業出版社，2008，332-349

[3]吳益東，沈晉良，陳進，等，用點滴法和浸葉法監測棉鈴蟲抗藥性的比較[J]，植物保護，1996，5：3-6

[4]唐振華，我國昆蟲抗藥性研究的現狀與展望[J]，昆蟲知識，2000，37(2)：97-101

[5]陳之浩，程羅根，張曉飛，等，小菜蛾抗藥性分子遺傳機理的探討與分析[J]，植物保護學報，2005，32(1)：67-70

[6]潘志萍，李敦松，昆蟲抗藥性監測與檢測技術研究進展[J]，應用生態學報，2006，17(8)：1539-1543

[7]王晨，顏忠誠，昆蟲的抗藥性[J]，生物學通報，2009，44(8)：10-12

[8]王芙蓉，吳薇，昆蟲對殺蟲劑的抗性機制概述[J]，陜西農業科學，2009，2：109-111

[9]劉澤文，韓召軍，張玲春，等，解毒酶系在褐飛虱對馬拉硫磷的抗性發展中的作用[J]，南京農業大學學報，2003，26(1)：24-28

[10]雷朝亮，昆蟲學通論[M]，北京：中國農業出版社，2006，55-62

[11]趙建周，吳世昌，顧顏忠，等，小菜蛾抗藥性治理對策研究[J]，中國農業科學，1996，29(1)：8-14

[12]姚洪渭，葉恭銀，程家安，同翅目害蟲抗藥性研究進展[J]，浙江農業學報，2002，14(2)：63-70

[13]趙善歡，昆蟲毒理學[M]，北京：中國農業出版社，1993，176-190

[14]勞什R.T.塔巴什尼可B.E.芮昌輝，等，害蟲的抗藥性[M]，北京：化學工業出版社，1995，23-30

[15]郭瑩，黃斌，趙景瑋，小菜蛾對毒死蜱的抗性與飼養溫度關系的研究[J]，武夷科學，2004，12(20)：111-113

[16]陳年春，李永平，覃柳祥，等，棉蚜抗性測定方法的研究[A]，中國化工學會農藥專業委員會第八屆年會論文集[C]，1996，124-127

[17]陳年春，農藥生物測定技術[M]，北京：中國農業大學出版社，1991，44-49