蛹蟲草菌絲固體法培養初探

摘要：試驗采用點接法進行了蛹蟲草菌絲適宜C、N源的篩選。結果表明，蛹草擬青霉可以利用的C、N源種類較多，常規飼料原料均可利用；根據C、N源篩選結果，設計了固體培養基配方；試驗所設計的豆粕、麩皮、玉米面等固體配方可以滿足蛹蟲草菌絲生長的要求，蛹蟲草菌絲的固體培養切實可行。

關鍵詞：蛹蟲草；菌絲；固體培養

中圖分類號：S567.304.3 文獻標識號：A 文章編號：1001—4942(2010)11—0066—03

眾所周知，蛹蟲草(Cordyceps militaris)是一種名貴藥材，含有多種生物活性成分，具有多種藥理作用，是藥用效果較好的保健食品。長期以來，蛹蟲草菌絲產品主要是采用液體深層發酵的生產方式，從生產設備到最終產品后處理等環節都需要大量生產成本，導致目前市場上蛹蟲草菌絲產品的價格偏高，制約了蛹蟲草的生產和應用范圍，比如在養殖業領域，利用蛹蟲草研發綠色高效的飼料添加劑已取得進展，蛹蟲草有望成為極具潛力的飼料添加劑。如何改進工藝，降低成本，則是能否實現蛹蟲草在養殖業中應用的關鍵。本試驗采用固體發酵培養蛹蟲草菌絲的方法，首先進行了蛹蟲草菌絲適宜生長的C、N源的篩選，在此試驗基礎上，又進行了三角瓶培養試驗及曲盤培養試驗，試圖簡化設備，降低成本，為蛹蟲草菌絲固體法培養提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

蛹草擬青霉(Paecilomyces militaris)由遼寧省微生物菌種保藏中心提供。

1.2 試驗所需器皿及儀器設備

滅菌鍋、培養皿、三角瓶、天平、移液管、無菌操作臺、接種針。

1.3 試驗方法

1.3.1 蟲草菌絲適宜C、N源篩選

①培養基的制作：參考《微生物學試驗》中的培養基配方。

唯一C源培養基：硫酸銨2.0g，硫酸鎂0.2g，磷酸氫二鈉0.5g，氯化鈣0.1g，磷酸氫二鉀0.5g，蒸餾水1000ml。常規滅菌后備用。唯一N源培養基：葡萄糖10g，硫酸鎂0.2g，硫酸鐵0.0005g，磷酸氫二鈉2.13g，氯化鈣0.005g，磷酸二氫鉀1.36g，蒸餾水1000ml。常規滅菌后備用。

②孢子懸浮液的制備：將蛹蟲草菌從試管中挑出，放人事前滅菌含有10ml無菌水的試管中，無菌條件下吸取一小滴，用血球計數板計數，計算孢子濃度。

③含菌平板的制作及點樣：事先將滅菌的培養皿底用記號筆打上“+”，將培養皿均分為4塊，無菌條件下倒入PDA，待平板凝固后，每皿接種1ml孢子懸浮液，涂抹均勻，放置1h后，分別接種C、N源(C、N源明細見表1)，使用滅菌的接種針蘸取少許，沾于培養基上，放置的位置盡量處于分區的中心位置，減少與其他營養源交叉的幾率。按事先劃好的分區每皿接種4種c源或N源，做好標記。以不接種任何c源或N源作為對照。每處理重復3次。置于25％條件下培養，及時觀察菌絲的長勢，并做好詳細記錄。

1.3.2 蛹蟲草在固體培養基上的培養情況

培養基配方：1號培養基：豆粕8％，麩皮20％，玉米面72％等；2號培養基：豆粕20％、麩皮20％、玉米面60％等；3號培養基：豆粕40％、麩皮20％、玉米面40％等。

營養液配方：硫酸銨2％，硫酸鎂0.5％，磷酸二氫鉀0.5％。料水比1：1。

按上述配方制作培養基，分裝于250ml三角瓶中，每瓶固含物約20g，常規滅菌30min，及時取出，將培養基振蕩均勻，使之松散，能保持良好的透氣性。待培養基放涼后，將菌液分別接種于1號、2號、3號培養基中，每處理5瓶，接種量為2ml。振蕩均勻，于25℃下避光培養，及時觀察記錄生長情況。

2 結果與分析

2.1 蛹蟲草菌絲生長適宜C、N源篩選結果

由表1可以看出，蛹草擬青霉可以利用的C、N源范圍較廣。試驗發現蛹草擬青霉對C源的要求不高，供試C源均能使其生長，其中較為適宜的有蔗糖、酒糟、玉米粉、大米粉、高粱粉、麥粒粉、甘薯粉等。在未接種C源部位菌絲生長非常微弱，幾乎不生長。試驗結果表明，N源對蛹草擬青霉生長影響大，除了硫脲不能為蛹蟲草利用外，其他N源均可利用。其中較適宜的有蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、酵母粉、豆餅粉、花生餅粉、蠶蛹粉、硫酸銨等。蛋白胨、牛肉膏、酵母膏比較適宜蛹蟲草菌絲的生長，但高濃度時可能會由于滲透壓比較高而抑制蛹蟲草菌絲的生長，導致平板上出現了透明圈的現象。

綜合本試驗結果的固體培養條件、培養效果、成本、原料獲得難易及營養需求等方面的因素，確定了以玉米面、麩皮和豆粕為主要原料設計固體培養料配方，并進行了固體培養初步試驗。

2.2 蛹蟲草在固體培養基上的生長情況

試驗發現，在接種后24h時，在2號培養基和3號培養基上的蟲草已有很明顯的白色菌絲生長于物料表層，而在1號培養基上生長緩慢。在培養至第5天時，各培養基上蛹蟲草菌絲的長勢良好；且可以離瓶。本試驗比較了不同配比的豆粕和玉米面對蛹蟲草菌絲生長的影響，從試驗結果可以看出，試驗所設計的配方可以滿足蛹蟲草菌絲生長的要求，蛹蟲草菌絲的固體培養切實可行。在本配方基礎上，豆粕水平在20％—40％范圍內對蛹蟲草菌絲生長的影響不大。可以根據實際需要增減豆粕量。

3 討論

本試驗采用的是比較適宜大量篩選的點接法，操作中點樣量不宜定量，有些觀察結果不精準，但仍能比較明顯的觀察是否適宜菌絲的生長。試驗表明，復合營養源比單一營養的利用情況好。C源濃度高也沒有導致抑菌圈的出現，而N源中，牛肉膏與酵母膏濃度大時，可能由于具有較高的滲透壓，出現了明顯的透明圈，但外圍菌絲長勢旺盛，因此如果培養基中有此類成分要注意其濃度的把握。各復合氮源的利用情況較好，相比較而言，無機氮的利用情況很不理想，硫酸銨的利用情況一般，其他幾類不宜利用。

在篩選C、N源的基礎上，設計了固體培養料配方，并進行了初步的培養試驗，結果表明，在培養周期為5天時，蟲草菌絲可以吃透物料。試驗所設計的配方可以滿足蛹蟲草菌絲快速生長的要求，蛹蟲草菌絲的固體培養切實可行。

本試驗僅是初步結果，今后還需開展一系列擴大培養試驗，如曲盤開放培養和袋栽培養等研究，在工藝方面要解決的問題也很多，如何從各個環節減少接觸雜菌的幾率，如何進一步縮短生長時間等等，從而降低生產成本，才能真正實現蛹蟲草在飼料領域的推廣應用。