蛹蟲草菌絲固體法培養(yǎng)初探

摘要：試驗(yàn)采用點(diǎn)接法進(jìn)行了蛹蟲草菌絲適宜C、N源的篩選。結(jié)果表明，蛹草擬青霉可以利用的C、N源種類較多，常規(guī)飼料原料均可利用；根據(jù)C、N源篩選結(jié)果，設(shè)計(jì)了固體培養(yǎng)基配方；試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的豆粕、麩皮、玉米面等固體配方可以滿足蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)的要求，蛹蟲草菌絲的固體培養(yǎng)切實(shí)可行。

關(guān)鍵詞：蛹蟲草；菌絲；固體培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S567.304.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001—4942(2010)11—0066—03

眾所周知，蛹蟲草(Cordyceps militaris)是一種名貴藥材，含有多種生物活性成分，具有多種藥理作用，是藥用效果較好的保健食品。長(zhǎng)期以來，蛹蟲草菌絲產(chǎn)品主要是采用液體深層發(fā)酵的生產(chǎn)方式，從生產(chǎn)設(shè)備到最終產(chǎn)品后處理等環(huán)節(jié)都需要大量生產(chǎn)成本，導(dǎo)致目前市場(chǎng)上蛹蟲草菌絲產(chǎn)品的價(jià)格偏高，制約了蛹蟲草的生產(chǎn)和應(yīng)用范圍，比如在養(yǎng)殖業(yè)領(lǐng)域，利用蛹蟲草研發(fā)綠色高效的飼料添加劑已取得進(jìn)展，蛹蟲草有望成為極具潛力的飼料添加劑。如何改進(jìn)工藝，降低成本，則是能否實(shí)現(xiàn)蛹蟲草在養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用的關(guān)鍵。本試驗(yàn)采用固體發(fā)酵培養(yǎng)蛹蟲草菌絲的方法，首先進(jìn)行了蛹蟲草菌絲適宜生長(zhǎng)的C、N源的篩選，在此試驗(yàn)基礎(chǔ)上，又進(jìn)行了三角瓶培養(yǎng)試驗(yàn)及曲盤培養(yǎng)試驗(yàn)，試圖簡(jiǎn)化設(shè)備，降低成本，為蛹蟲草菌絲固體法培養(yǎng)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

蛹草擬青霉(Paecilomyces militaris)由遼寧省微生物菌種保藏中心提供。

1.2 試驗(yàn)所需器皿及儀器設(shè)備

滅菌鍋、培養(yǎng)皿、三角瓶、天平、移液管、無菌操作臺(tái)、接種針。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蟲草菌絲適宜C、N源篩選

①培養(yǎng)基的制作：參考《微生物學(xué)試驗(yàn)》中的培養(yǎng)基配方。

唯一C源培養(yǎng)基：硫酸銨2.0g，硫酸鎂0.2g，磷酸氫二鈉0.5g，氯化鈣0.1g，磷酸氫二鉀0.5g，蒸餾水1000ml。常規(guī)滅菌后備用。唯一N源培養(yǎng)基：葡萄糖10g，硫酸鎂0.2g，硫酸鐵0.0005g，磷酸氫二鈉2.13g，氯化鈣0.005g，磷酸二氫鉀1.36g，蒸餾水1000ml。常規(guī)滅菌后備用。

②孢子懸浮液的制備：將蛹蟲草菌從試管中挑出，放人事前滅菌含有10ml無菌水的試管中，無菌條件下吸取一小滴，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)算孢子濃度。

③含菌平板的制作及點(diǎn)樣：事先將滅菌的培養(yǎng)皿底用記號(hào)筆打上“+”，將培養(yǎng)皿均分為4塊，無菌條件下倒入PDA，待平板凝固后，每皿接種1ml孢子懸浮液，涂抹均勻，放置1h后，分別接種C、N源(C、N源明細(xì)見表1)，使用滅菌的接種針蘸取少許，沾于培養(yǎng)基上，放置的位置盡量處于分區(qū)的中心位置，減少與其他營(yíng)養(yǎng)源交叉的幾率。按事先劃好的分區(qū)每皿接種4種c源或N源，做好標(biāo)記。以不接種任何c源或N源作為對(duì)照。每處理重復(fù)3次。置于25％條件下培養(yǎng)，及時(shí)觀察菌絲的長(zhǎng)勢(shì)，并做好詳細(xì)記錄。

1.3.2 蛹蟲草在固體培養(yǎng)基上的培養(yǎng)情況

培養(yǎng)基配方：1號(hào)培養(yǎng)基：豆粕8％，麩皮20％，玉米面72％等；2號(hào)培養(yǎng)基：豆粕20％、麩皮20％、玉米面60％等；3號(hào)培養(yǎng)基：豆粕40％、麩皮20％、玉米面40％等。

營(yíng)養(yǎng)液配方：硫酸銨2％，硫酸鎂0.5％，磷酸二氫鉀0.5％。料水比1：1。

按上述配方制作培養(yǎng)基，分裝于250ml三角瓶中，每瓶固含物約20g，常規(guī)滅菌30min，及時(shí)取出，將培養(yǎng)基振蕩均勻，使之松散，能保持良好的透氣性。待培養(yǎng)基放涼后，將菌液分別接種于1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)培養(yǎng)基中，每處理5瓶，接種量為2ml。振蕩均勻，于25℃下避光培養(yǎng)，及時(shí)觀察記錄生長(zhǎng)情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)適宜C、N源篩選結(jié)果

由表1可以看出，蛹草擬青霉可以利用的C、N源范圍較廣。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛹草擬青霉對(duì)C源的要求不高，供試C源均能使其生長(zhǎng)，其中較為適宜的有蔗糖、酒糟、玉米粉、大米粉、高粱粉、麥粒粉、甘薯粉等。在未接種C源部位菌絲生長(zhǎng)非常微弱，幾乎不生長(zhǎng)。試驗(yàn)結(jié)果表明，N源對(duì)蛹草擬青霉生長(zhǎng)影響大，除了硫脲不能為蛹蟲草利用外，其他N源均可利用。其中較適宜的有蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、酵母粉、豆餅粉、花生餅粉、蠶蛹粉、硫酸銨等。蛋白胨、牛肉膏、酵母膏比較適宜蛹蟲草菌絲的生長(zhǎng)，但高濃度時(shí)可能會(huì)由于滲透壓比較高而抑制蛹蟲草菌絲的生長(zhǎng)，導(dǎo)致平板上出現(xiàn)了透明圈的現(xiàn)象。

綜合本試驗(yàn)結(jié)果的固體培養(yǎng)條件、培養(yǎng)效果、成本、原料獲得難易及營(yíng)養(yǎng)需求等方面的因素，確定了以玉米面、麩皮和豆粕為主要原料設(shè)計(jì)固體培養(yǎng)料配方，并進(jìn)行了固體培養(yǎng)初步試驗(yàn)。

2.2 蛹蟲草在固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在接種后24h時(shí)，在2號(hào)培養(yǎng)基和3號(hào)培養(yǎng)基上的蟲草已有很明顯的白色菌絲生長(zhǎng)于物料表層，而在1號(hào)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢。在培養(yǎng)至第5天時(shí)，各培養(yǎng)基上蛹蟲草菌絲的長(zhǎng)勢(shì)良好；且可以離瓶。本試驗(yàn)比較了不同配比的豆粕和玉米面對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)的影響，從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的配方可以滿足蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)的要求，蛹蟲草菌絲的固體培養(yǎng)切實(shí)可行。在本配方基礎(chǔ)上，豆粕水平在20％—40％范圍內(nèi)對(duì)蛹蟲草菌絲生長(zhǎng)的影響不大。可以根據(jù)實(shí)際需要增減豆粕量。

3 討論

本試驗(yàn)采用的是比較適宜大量篩選的點(diǎn)接法，操作中點(diǎn)樣量不宜定量，有些觀察結(jié)果不精準(zhǔn)，但仍能比較明顯的觀察是否適宜菌絲的生長(zhǎng)。試驗(yàn)表明，復(fù)合營(yíng)養(yǎng)源比單一營(yíng)養(yǎng)的利用情況好。C源濃度高也沒有導(dǎo)致抑菌圈的出現(xiàn)，而N源中，牛肉膏與酵母膏濃度大時(shí)，可能由于具有較高的滲透壓，出現(xiàn)了明顯的透明圈，但外圍菌絲長(zhǎng)勢(shì)旺盛，因此如果培養(yǎng)基中有此類成分要注意其濃度的把握。各復(fù)合氮源的利用情況較好，相比較而言，無機(jī)氮的利用情況很不理想，硫酸銨的利用情況一般，其他幾類不宜利用。

在篩選C、N源的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了固體培養(yǎng)料配方，并進(jìn)行了初步的培養(yǎng)試驗(yàn)，結(jié)果表明，在培養(yǎng)周期為5天時(shí)，蟲草菌絲可以吃透物料。試驗(yàn)所設(shè)計(jì)的配方可以滿足蛹蟲草菌絲快速生長(zhǎng)的要求，蛹蟲草菌絲的固體培養(yǎng)切實(shí)可行。

本試驗(yàn)僅是初步結(jié)果，今后還需開展一系列擴(kuò)大培養(yǎng)試驗(yàn)，如曲盤開放培養(yǎng)和袋栽培養(yǎng)等研究，在工藝方面要解決的問題也很多，如何從各個(gè)環(huán)節(jié)減少接觸雜菌的幾率，如何進(jìn)一步縮短生長(zhǎng)時(shí)間等等，從而降低生產(chǎn)成本，才能真正實(shí)現(xiàn)蛹蟲草在飼料領(lǐng)域的推廣應(yīng)用。