天麻多糖的純化工藝研究

【摘要】對本實驗室提取的川產天麻多糖粗提液進行分離純化，研究結果表明:采用酶法除蛋白效果比較理想，一次就能達到比較好的效果，胰蛋白酶用量為2.0U/mg，處理時間以5h最好;酶解結合一次Sevag法再醇沉后，蛋白脫出率為90.1%;進樣體積8ml、樣品濃度4%、流速0.8ml/min時，Sepharose 6 Fast Flow凝膠分離效果最好。

【關鍵詞】天麻;多糖;純化

【中圖分類號】R282.71【文獻標識碼】A【文章編號】1007-8517(2010)14-102-2

Purification of Gastrodia elata BL Polysaccharides

ZHU Xiao-xia，Zhang yong

(School of Material Science and Engineering，Southwest University of Science and Technology，Sichuan Mianyang，621010)

Abstract:The results of methods(Sevag，enzyme and enzyme decomposition with Sevag)showed that:Enzyme method is the best one to eliminate protein with dosage of enzyme 2.0U/mg for 5 hours.Enzyme decomposition with Sevag，then precipitated with ethanol.Remove rate of protein is 90.1%。The separation conditions of Sepharose 6 Fast Flow gel are 8ml 0f sample volume，4% of samples concentration 4%，and the velocity of 0.8ml/min.

Key word:Gastrodia elata BL;polysaccharides;purification

糖類物質是地球上數量最多的一類有機化合物，可廣泛應用于醫藥、保健品及功能食品，作為綠色生物醫藥產品具有廣闊的市場前景[1]。目前多糖產品開發相當熱門，也卓有成效。多糖的生理功能與其純度和化學結構有著重要的關系，多糖的提取純化是其研究的基礎。活性多糖的分離純化是指獲得粗的活性多糖提取液后，除去共存雜質，進行混合糖的相互分離。微生物多糖去蛋白常采用Seveag法、三氟三氯乙烷法;植物多糖去蛋白[2]常用三氯乙酸法，也可以用蛋白質水解酶使樣品中的蛋白質部分降解后，再用Seveage法效果會更好。多糖的分離一般主要有分級沉淀、季銨鹽沉淀法、透析法、金屬鹽沉淀法和制備性區域電泳等，但目前大多采用DEAE-凝膠(二甲氨基乙基凝膠)或其他各種不同類型的凝膠柱層析以及離子交換色譜法[3]，根據文獻和考慮到多糖的性質，宜采用凝膠柱層析技術進行分離。本文對天麻多糖純化進行了詳細研究。

1原材料、試劑

本實驗室所得未經醇沉的天麻多糖粗提液[4];乙醇、氯仿、正丁醇均為成都市科龍化工試劑廠出品(分析純AR);凝膠Sepharose 6 Fast Flow、Sephacryl-S300均為Amersham公司出品;牛血清白蛋白(中國醫藥上海化學試劑公司生產)，考馬斯亮蘭G-250(中國醫藥上海化學試);胰蛋白酶(上海化學試劑公司)。

2試驗方法

2.1蛋白質濃度測定

稱取牛血清白蛋白22mg，置10mL容量瓶中，加水溶解后稀釋至刻度制成貯備液。分別吸取貯備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，加水稀釋至1mL，向各管中加入5mL考馬斯亮蘭G-250溶液，混合均勻后，在30℃下水浴加熱5min，以蒸餾水為空白，在595nm波長處測定吸光度，得回歸方程為:Y=303.54x-1.983，相關系數:r=0.999，呈良好的線性關系。

2.2天麻多糖除蛋白處理

天麻多糖脫蛋白的目的是除去其中的游離蛋白，而對其中糖含量有無影響是該工藝必須考慮的問題。本實驗采用了Sevage法和酶+Sevage法來去除蛋白質。根據正交實驗結果采取最優化條件浸提天麻粗粉，得到的粗提液濃縮備用。

2.3凝膠柱層析

本文采用Sepharose 6 Fast Flow 凝膠，Sepharose 6 Fast Flow需要手動裝柱。本文對Sepharose 6 Fast Flow凝膠的分離因素(樣品體積、樣品濃度、洗脫速度)進行了試驗，得出最佳分離條件。

3結果與討論

3.1Sevag法脫蛋白

糖含量隨著脫蛋白次數的增加而減少。經過1次-4次脫蛋白處理的天麻多糖中含糖量與其他幾次處理的含糖量存在極顯著差異，而經過7次脫蛋白處理與經過11次脫蛋白處理糖含量無顯著差異。不同次數脫蛋白處理間天麻多糖中糖量損失的程度不同，基本上呈遞減趨勢，但經過前4次脫蛋白處理后天麻多糖中糖量損失最大，占所有損失量的86.9%。脫蛋白次數超過8次，糖含量變化不大。

蛋白質含量隨著脫蛋白次數的增加而減少，但減少幅度并不大，經過8次脫蛋白后天麻多糖中蛋白質含量減少了95.12%，脫蛋白的效果主要在前5次，天麻前5次脫蛋白量占總量的81.99%。采用Sevag法要將天麻多糖的蛋白質除盡，至少需要8次。

3.2酶法脫蛋白

酶法脫蛋白后，剩余蛋白質含量最少的效果最好，從上面的試驗結果可知4、5、6號的蛋白質吸光度比較小(見表1)，根據標準曲線可算出蛋白質濃度，由上表的多糖液體積可知，編號4的脫蛋白效果最好。

3.3酶法+Sevag法脫蛋白

利用蛋白酶降解+Sevag法除蛋白，由于酶的降解作用，使得蛋白質被酶切成小肽段，處于水溶解性較好的狀態，這些小肽段用Sevag法不能沉淀出來。醇沉后，小肽段處于溶解狀態被除去。酶解結合一次Sevag法再醇沉后，蛋白脫出率為76.8%，(多糖含量/蛋白含量)值達到4.24，效果比較理想，減少了后續有機溶劑除蛋白的次數，降低了多糖隨凝膠物沉淀而損失的可能，多糖的得率提高。但是酶解結合Sevag法步驟繁多，工作強度較大;如采用效果較好得進口蛋白酶，成本較高。

表2酶法結合法脫蛋白結果

酶解前酶解一次Sevag法后醇沉后

蛋白質含量(mg/ml)1.250.750.29

蛋白質除率(%)_40.076.8

多糖含量(mg/ml)2.601.661.23

(多糖量/蛋白質量)值2.082.214.24

3.4Sepharose 6 Fast Flow分離

3.4.1樣品體積對分辨率的影響

樣品體積是由柱長和欲分離物質所允許的分辨力來決定的。制備分離的樣品體積較大，為床體積的25%-30%，分級分離時樣品體積要小，一般為床體積的1%-4%。樣品體積必須小于分離體積才能得到較好的分離效果。本試驗分別以6、8、10、12ml樣品體積上柱進行試驗。

當樣品體積增加時，多糖的得率就隨之增大，但當加樣量超過10ml(占柱體積的5%)時，峰形變寬，分離效果差，說明樣品量已超過凝膠柱的分離能力，所以采用Sepharose 6 Fast Flow凝膠進行分級分離時，樣品體積應小于柱體積的5%。

3.4.2樣品濃度對分辨率的影響

天麻多糖的濃度與粘度相關，濃度越大、粘度越大。樣品溶液的粘度對分離效果影響很大，所有在凝膠層析時，必須嚴格控制樣品溶液的濃度，一般濃度在5%左右。本論文以樣品溶液濃度3%、4%、6%進行試驗5。

隨著樣品濃度增高，洗脫峰的峰形變寬不規則。當樣品濃度為6%時，兩個組分根本分不開，無法進行分離。樣品的濃度增加，必然造成在柱內的流動速度減慢，導致拖尾使峰形變寬，分離效果不好。但是濃度也不是越小越好。樣品濃度小，每次純化的樣品量較小，根據試驗結果，我們選取濃度4%進行分離。

3.4.3洗脫劑流速對分辨率的影響

在凝膠層析時，洗脫劑流速是分離效果的主要影響因素之一。本論文以洗脫劑流速0.8ml/min、1.2ml/min、1.6ml/min進行試驗。速度過快，凝膠來不及和多糖分子作用，起不到分離的效果，選用0.8ml/min的流速，能將天麻多糖很好的分開。

3.4.4最適條件下分分離

從上面的試驗可知，進樣體積8ml、樣品濃度4%、流速0.8ml/min時，Sepharose 6 Fast Flow凝膠分離效果最好。

4結論

本文系統的進行了天麻粗多糖原料液的脫蛋白工藝研究。試驗結果表明:Sevag法雖然條件溫和，但效率不高，一般要重復8次左右，方能去盡蛋白質;采用酶法除蛋白效果比較理想，一次就能達到比較好的效果，減少多糖損失，節約試劑用量，酶解結合一次Sevag法再醇沉后，蛋白脫出率為76.8%，(多糖含量/蛋白含量)值達到4.24;對Sepharose 6 Fast Flow凝膠的分離工藝進行了優化:進樣體積8ml、樣品濃度4%、流速0.8ml/min時，Sepharose 6 Fast Flow凝膠分離效果最好，峰形對稱，無大的拖尾。

參考文獻

[1] 張艷萍，蔣家新.多糖化合物的研究進展[J].糧油食品科技，2004，6(12):12-13.

[2] 劉成梅.天然產物有效成分的分離與應用[M].北京:化學工業出版社，2003:283-285.

[3] Hostettmann K，Marston A，趙維民，等.制備色譜技術-在天然大分子物分離中的應用[M].科學出版社，2000，256.

[4] 朱曉霞，羅學剛.天麻多糖提取工藝優化[J].時珍國醫國藥，2007，18(4):906-907.