分子生物學診斷技術的應用(一)

中圖分類號:S854.4+3文獻標識碼:B文章編號:1007-273X(2010)09-0004-06

編者按:隨著分子生物學技術的飛速發展，尤其是分子遺傳學的進步，大大提高了動物病原的診斷水平。動物病原的實驗室診斷技術已從常規的病原分離鑒定以及抗原和抗體的免疫學檢測，進入到可對病原基因序列和結構直接進行測定的分子生物學水平，同時也促進了疫病快速診斷技術發展。近幾年隨著國家對市縣級動物疫病防控設備投資逐年加大，疫病防控診斷平臺建設不斷加強，獸醫技術人員希望普及動物分子生物學診斷技術。本刊特邀湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所楊峻研究員對分子生物學診斷技術在獸醫學科領域的應用進行概述，為大家在實際應用時提供參考。主要內容包括核酸探針技術、單克隆抗體技術、核酸擴增、核酸電泳、免疫印跡技術、圖譜分析、核酸序列分析、DNA芯片技術等。

1核酸探針技術

1.1核酸探針技術的原理

化學及生物學意義上的探針(Probe)，是指與特定的靶分子發生特異性相互作用，并可被特殊的方法探知的分子?？贵w—抗原、生物素—抗生物素蛋白、生長因子—受體的相互作用都可以看做是探針與靶分子的相互作用。核酸探針技術的原理是堿基配對。互補的兩條核酸單鏈通過退火形成雙鏈，這一過程稱為核酸雜交。核酸探針是指帶有標記物的已知序列的核酸片段，它能和與其互補的核酸序列雜交，形成雙鏈，所以可用于核酸樣品中特定基因序列的檢測。每一種病原體都具有獨特的核酸片段，通過分離和標記這些片段就可制備出探針，用于疾病的診斷等研究。

1.2核酸探針的種類與用途

按來源及性質劃分:可將核酸探針分為基因組DNA探針、cDNA探針、RNA探針和人工合成的寡核苷酸探針等幾類。作為診斷試劑，較常使用的是基因組DNA探針和cDNA探針。其中，前者應用最為廣泛，它的制備可通過酶切或聚合酶鏈反應(PCR)從基因組中獲得特異的DNA后將其克隆到質?；蚴删w載體中，隨著質?；蚴删w的增殖而獲得大量高純度的DNA探針。將RNA進行反轉錄，所獲得的產物即為cDNA探針適用于RNA病毒的檢測。cDNA探針序列也可克隆到質粒或噬菌體中，以便大量制備。將RNA標記也可作為核酸分子雜交的探針，但由于來源極不方便，且RNA極易被環境中大量存在的核酸酶降解，操作不便，因此應用較少。用人工合成的寡聚核苷酸片段作為核酸雜交探針應用十分廣泛，可根據需要隨心所欲合成相應的序列，可合成僅有幾十個bp的探針序列，對于檢測點突變和小段堿基的缺失或插入尤為適用。

按標記物劃分:有放射性標記探針和非放射性標記探針兩大類。放射性標記探針用放射性同位素作為標記物。放射性同位素是最早使用，也是目前應用最廣泛的探針標記物。常用同位素有32P、3H、35S。其中，以32P應用最普遍。放射性標記的優點是靈敏度高，可以檢測到Pg級;缺點是易造成放射性污染，同位素半衰期短，不穩定，成本高等。因此，放射性標記的探針不能實現商品化。目前，許多實驗室都致力于發展非放射性標記的探針。

目前應用較多的非放射性標記物是生物素(biotin)和地高辛(digoxigenin)。兩者都是半抗原。生物素是一小分子水溶性維生素，對親合素有獨特的親和力，兩者能形成穩定的復合物，通過連接在親合素上的顯色物質(如酶、熒光素等)進行檢測。地高辛是—種類醇半抗原分子，可利用其抗體進行免疫檢測，原理類似于生物素的檢測。地高辛標記核酸探針的檢測靈敏度可與放射性同位素標記的相當，而特異性優于生物素標記，其應用日益廣泛。

核酸探針技術是目前分子生物學中應用最廣泛的技術之一，是定性或定量檢測RNA或DNA序列的有力工具。核酸探針可用以檢測任何特定病原微生物，并能鑒別密切相關的毒(菌)株和寄生蟲。目前，各種常見病毒病的診斷和研究都已應用到核酸探針技術，這方面的研究報道數以萬計且與日俱增。但該項技術的操作畢竟比常見方法復雜，費用較高，在動物檢疫中尚未推廣。多在實驗室內對病原作深入研究時使用。

1.3核酸探針的標記方法

1.3.1放射性同位素標記法將放射性同位素如32P連接到某種脫氧核糖核苷三磷酸上為標記物，然后通過切口平移法標記探針。

切口平移法(nick translation)是利用大腸桿菌DNA聚合酶I(E. coli DNA polymerase Ⅰ)的多種酶促活性將標記的dNTP摻入到新型DNA鏈中去，形成均勻標記高比活DNA探針。其操作方法如下:取1μg DNA溶于少量無菌雙蒸水中，加入5μL距離大約10×切口平移緩沖液(0.5mol/L Tris-HCl，pH7.2;0.1mol/L MgSO4;1mmol/L二硫蘇糖醇;500μg/mL牛血清白蛋白)，加入除標記物(如α-32P-Datp)外的其他3種dNTP(如dCTP、dGTP、dTTP)溶液、20mmol/L溶液各1μL;加入10μL標記物溶液，加入無菌雙蒸水至終體積為46.5μL，混勻，加入0.5μL稀釋的Dnase 1溶液，混勻;加入1μL E.coli DNA polymerase I，混勻;置14～16℃反應1～2h。

1.3.2非放射性標記法將生物素、地高辛連接在dNTP上，然后象放射性標記一樣用酶促聚合法摻入到核酸鏈中制備標記探針。也可讓生物素、地高辛等直接與核酸進行化學反應而連接上核酸鏈。其中，生物素的光化學標記法較為常用。其原理是利用可能被可見光激活的生物素衍生物——光敏生物素，光敏生物素與核酸探針混合后，在強RNA的標記，探針可在-20℃下保存8～18個月。具體操作方法如下:將雙鏈DNA變性或用NaOH處理形成缺口(單鏈DNA或RNA毋需處理)，將核酸樣品溶于水;暗室下在微量離心管中加入10μg DNA，1mg/L光敏生物素20μL，加水至50μL，混勻;冰浴中打開離心管蓋，在300～500W燈下照射10min(液面距燈泡10cm);加入100μL 0.1mol/L Tris-HCI，pH8.0，加入100μL 2-丁醇抽提兩次，離心，棄上層;乙醇沉淀核酸探針;用70%乙醇漂洗，真空抽干，備用。

1.4核酸雜交方法

雜交技術有固相雜交和液相雜交之分。固相雜交技術目前較為常用，先將待測核酸結合到一定的固相支持物上，再與液相中的標記探針進行雜交。固相支持物常用硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane，簡稱NC膜)或尼龍膜(nylon membrane)。

固相雜交包括膜上印跡雜交和原位雜交。前者包括三個基本過程:第一，通過印跡技術將核酸片段轉移到固相支持物上;第二，用標記探針與支持物上的核酸片段進行雜交;第三，雜交信號的檢測。用探針對細胞或組織切片中的核酸雜交并進行檢測的方法稱之為核酸原位雜交。其特點是將靶分子固定在細胞中，細胞固定在載玻片上，以固定的細胞替代純化的核酸，然后將載玻片浸入溶有探針的溶液里，探針進入組織細胞與靶分子雜交，而靶分子仍固定在細胞上，據此可以判定有無該病原體的感染等。原位雜交不需從組織中提取核酸，對于組織中含有極低的靶序列也有極高的敏感性，在臨床應用上有獨特的意義。

近年來液相雜交技術有所發展。液相雜交與固相雜交的主要區別是不用純化或固定靶分子，探針與靶序列直接在溶液里作用。液相雜交步驟有所簡化，速度有所提高，增加了特異性和敏感性，但與臨床診斷所要求的特異性和敏感性還有一定的距離。

各種雜交技術中，膜上印跡雜交技術應用最為廣泛。

1.5核酸印跡技術

斑點印跡(dot-blot):將待測核酸樣品變性后直接點樣在膜上，稱之為斑點印跡。為使核酸牢固結合在膜上，通常還將點樣后的膜進行80℃真空烘烤2h。應用斑點印跡技術，可在一張膜上同時進行多個樣品的檢測，操作簡便、快速，在臨床診斷中應用較廣。適合進行特定基因的定性及定量研究。但不能鑒定所測基因的分子量。

Southern印跡(southern blot):這是指將DNA片段經瓊脂糖凝膠電泳分離后轉移到固相支持物上的過程。常規處理如下，先用限制性內切酶對DNA樣品進行酶切處理，經瓊脂糖凝膠電泳將所得DNA片段按分子量大小分離，接著對凝膠進行變性處理，使雙鏈DNA解離成單鏈，并將其轉移到NC膜或其他固相支持物上，轉移后各DNA片段的相對位置保持不變。用探針與經Southern印跡處理的DNA樣品雜交，可鑒定待測DNA的大小、進行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性片段長度多態性分析(RFLP)等。

2單克隆抗體技術

2.1單克隆抗體技術應用原理與研究進展

2.1.1單克隆抗體技術應用原理針對病原某一特異蛋白制備的抗體通過淋巴細胞雜交瘤技術進行純化生產(簡稱單抗)，單抗作為抗原物質的分子識別工具除在生物醫學基礎研究、免疫和治療方面得到廣泛應用外，在疫病診斷和檢疫中正在并將繼續發揮重要作用。

單克隆抗體與多克隆抗體的本質區別:單克隆抗體是源于一個B淋巴細胞的雜交瘤細胞分泌的針對抗原的同一表位的抗體;而多克隆抗體(簡稱多抗)是由免疫動物的無數不同的B淋巴細胞分泌的針對抗原不同表位的性質各異的混合抗體。單抗是同質的，多抗是異質的。把握單抗與多抗的這些重要區別，對于正確應用這兩類抗體是十分重要的。

2.1.2單克隆抗體技術研究進展自1975年建立該項技術以來，目前已取得新的重要進展，主要有以下幾方面。

融合技術。除用聚乙二醇融合劑外，發展了融合、激光融合和定向融合技術。用FOX系骨髓瘤細胞與Rb8-12Balb/c動物脾細胞融合，存活的雜交瘤細胞均能分泌抗體。有的細胞生長因子可促進瘤細胞生長，在融合和克隆時把它加進培養液中，可不加飼養細胞，并能提高融合率、克隆成活率和陽性率。

發展了異源和非鼠源雜交瘤。用動物骨髓瘤細胞與其他動物(如兔、牛、豬、綿羊等)脾細胞融合，獲得異源雜交瘤。但融合率低，穩定性差。近年來報道了雞和豬骨髓瘤細胞系研究成功，為研究雞和豬源單抗準備了前提條件。

發展了雙特異性抗體。這是兩種分泌不同單抗的雜交瘤細胞間融合產生的雜交瘤。其方法是先研制對HAT敏感的親本雜交瘤細胞，然后與另一雜交瘤細胞融合，篩選。篩選出的雜交瘤分泌的單抗為雙特異性。如單抗的一臂結合過氧化物酶，另一臂結合抗原，省去標記酶的過程。

發展了嵌合抗體、重構抗體和小分子抗體。嵌合抗體是應用重組DNA技術對抗體基因進行置換，從而改變原來抗體性質。如用編碼HRP或AP酶基因取代鼠單抗C區基因，表達產物既具有抗體活性，又具有酶活性;再如將毒素分子的編碼基因與單抗V區基定簇互補的結構，即互補性決定區(CDR)基因取代入抗體可變區的CDR基因，表達具有動物單抗特異性的源抗體。通過DNA重組技術可以得到大小為完整IgG 1/3的FabA片段、為完整IgG 1/6的只由重鏈可變區構成的單鏈抗體以及為完整IgG分子1/12的只有VH區的單域抗體。

免疫球蛋白與抗原的結合主要決定于重鏈，輕鏈作用差些。一些不同特異性的抗體的VL區很相似。因此抗體基因庫中VH基因與有限數目的VL基因排列組合可以構成任何需要的抗體。抗體基因工程可按人的需要構建新的抗體分子，將從根本上改變領先免疫獲得抗體的狀況。

2.2單克隆抗體的應用

自1975年Kohler和Mitstein報道，通過細胞融合建立能產生單克隆抗體的雜交瘤技術以來，這個最基礎的具有開創性的理論在生物科學的基礎研究以及醫學、預防醫學、農業科學等領域的廣泛的實踐，充分顯示它對生命科學各領域產生的巨大而深遠的影響。由于單抗有著免疫血清或抗體無法比擬的優點，迄今全世界已研制成數以千計的單抗，有的已投入市場，有的正在進行應用考核和深入觀察。

2.2.1在診斷學中的應用單抗應用最廣泛的是診斷，主要用于病原診斷、病理診斷和生理診斷，隨著微生物學、寄生蟲學、免疫學的研究進展，人類對感染性和寄生蟲性疾病有了新的認識，一個病原體存在許多性質不同的抗原，在同一抗原上，又可能存在許多性質不同的屬、種、群、型特異性抗原，采用雜交瘤技術，可以獲得識別不同抗原或抗原決定簇的單抗，從而可以對感染性疾病和寄生蟲病進行快速準確的診斷，同時可以用于調查疾病流行情況，流行毒株或蟲株分類鑒定，為病原的防疫治療提供資料。目前應用單抗診斷試劑診斷的人、畜禽、植物等病毒、細菌或寄生蟲病已有上百種，其中乙肝、狂犬病、乙型腦炎等人獸共患病30余種;雞新城疫、馬立克、豬瘟等畜禽病20余種;植物病毒病10余種;人、畜禽細菌病20余種;弓形蟲、瘧疾、旋毛蟲等寄生蟲病30余種。另外，單抗還成功應用于含量低微的激素、細菌毒素、神經遞質的腫瘤細胞抗原的診斷。

2.2.2單抗應用于臨床治療用單抗治療腫瘤是醫學界寄予厚望的一項研究，目前已研制了的腫瘤單抗有:胃腸道腫瘤、黑色毒瘤、肺癌等數十種，用單抗可能的治療途徑是采用高親并特異的單抗，偶聯藥物或毒素后(生物導彈)以定向殺傷腫瘤，目前該研究在實驗動物中已獲得成功，而單獨使用單抗治療人類惡性腫瘤獲得成功的例子國外也有報道。使用單抗治療畜禽傳染病，尤其是病毒病如雞傳染性法氏囊，成效十分顯著。近年來采用基因工程技術將抗體基因轉入植物可以生產大量的單抗，另外具有不同用途的嵌合抗體、人源單抗、重構抗體、小分子抗體的出現，為應用單抗治療各類疾病拓寬了道路。

2.2.3單抗是生物學研究的有力工具目前，單抗已廣泛應用于不同學科，其中一部分是為基礎理論研究服務的，在病原方面可用于分類、分型和鑒定毒株，可用于探查抗原結構以及用于抗感染免疫機制和中和抗原的研究，結合分子生物學方法，可以確認病毒抗原蛋白的編碼基因，基因突變和轉譯產物的加工、處理、組裝過程，從而進一步研制基因重組疫苗。作為一種特異的生物探針，通過單抗的免疫組化定位，研究細胞的生理功能和疾病的病因、發病機制，對激素和受體可應用單抗的免疫分析，免疫細胞的定位，大大促進了激素和受體結構與功能、激素作用機理以及內分泌自身免疫性疾病病因的研究進展。另外單抗已應用于神經系統、血液系統、藥理學和系統發育學、畜牧育種及性別控制等學科的研究工作中，從而極大的推動了整個生物學科的發展。

2.3材料與試劑

細胞融合和雜交細胞培養用試劑的配制:

RPMI-1640基礎培養液1 000mL:RPMI-1640粉7.4g，丙酮酸鈉0.5g，用900mL三蒸水(或無離子水再經過雙蒸)，通CO2攪拌溶解。稱取1.8g NaHCO3，用少量三蒸水溶解，邊攪拌邊加入RPMI-1640液中。補足1 000mL，通過0.22μm濾膜正壓過濾除菌(用CO2鋼瓶加壓)，分裝，置30℃，菌檢48h，4℃存放。有效期不超過3個月。

RPMI-1640完全培養液100mL:雙抗(青、鏈霉素)1.0mL，3%L-谷氨酰胺2.5mL，犢牛血清15.0mL，1640基礎培養液81.5mL。用時現配，4℃下存放不超過1周，用于細胞融合和克隆化培養的全培養液，可將小牛血清增至20%。

L-谷氨酰胺溶液200mL(3%):L-谷氨酰胺5.846g，三蒸水200mL;加熱至50℃使全溶，0.22μm膜濾除菌，-20℃保存。

雙抗溶液:青霉素(鈉鹽)100IU，鏈霉素(硫酸鹽)1g，溶于100mL滅菌三蒸水中，小量分裝，-20℃凍存。

篩選小牛血清的方法:取一份生長旺盛的雜交瘤細胞(或骨髓瘤細胞)，按有限稀釋法用不含血清的培養液稀釋成每毫升5個和100個細胞，按每孔0.1mL分種于不含飼養細胞的96孔板中。其中，一部分板孔加待試小牛血清，一部分板孔加已知優良血清，每孔1滴(約0.025mL)。在37℃ 5%～7%CO2溫箱中培養7d左右，計數每孔細胞克隆靈敏情況并估測群落大小，按克隆細胞的相對成活率和生長速度評價血清優劣。

50%聚乙二醇(PEG)溶液:取約3g PEG(MW 1520或4000)放入試管中，加蓋包有硫酸紙的棉塞，121℃ 0.069~0.075MPa，高壓滅菌10min。當融化的7.5% NaHCO3調pH值至7.1，用溫熱的吸管吹吸混拌均勻，按0.8mL/支分裝在安瓿中，放-20℃凍存備用。

7.5%NaHCO3溶液:取7.5gNaHCO3溶于100mL三蒸水中，0.22μm膜濾除菌，分裝小瓶中，4℃保存。

氨基喋呤(A)貯存液:取5.16mL氨基喋呤，加90mL三蒸水，滴加0.5mL NaOH助溶，待完全溶解后，加0.5mL 1mol/L HCl中和，補足三蒸水至100mL，0.22μm膜濾除菌，分裝4mL/瓶，-20℃保存。

次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷(HT)貯存液:取13.61mL H和38.8mL T，加45～50℃三蒸水至100mL，使之溶解，0.22μm膜濾除菌，分裝4mL/瓶，-20℃保存。

HT培養液:在完全培養液中按1%加HT貯存液。

HAT培養液:在完全培養液中分別按1%加A貯存液和HT貯存液。

8-氮鳥嘌呤貯存液:取20mL 8-氮鳥嘌呤加入1mL 1mol/L NaOH中，溶解后加三蒸水至100mL，0.22μm膜濾除菌，按4mL/瓶分裝，-20℃保存。

8-氮鳥嘌呤培養液:向全培養液中按1%加入8-氮鳥嘌呤，即為含20μg/mL的全培養液。

2.4方法與操作

2.4.1抗原制備選用什么形式的抗原免疫動物?選用什么形式的抗原作篩檢抗原?這是研制單抗設計中需要著重考慮的策略。一般來說，免疫原越純，雜交瘤細胞的陽性率越高。某些抗原甚至不提純，雜交瘤細胞也有相當高的陽性率。應根據研究對象的具體情況和研究目的而定。研制病毒特異性單抗往往經密度梯度離心或層析純化過的病毒檢抗原。但用粗提或不提純的病毒抗原免疫動物也能獲得成功。如以新城疫病毒濃縮尿囊液或疫苗、馬立克氏病毒感染細胞的超聲波粉碎抗原、口蹄疫病毒和豬水泡病病毒聚乙二醇或硫酸銨濃縮抗原作免疫抗原進行雜交瘤試驗，均曾獲得成功。研制細菌單抗往往用全菌或其裂解物作免疫抗原。研制抗原特定表位的單抗時需精心設計技術路線，如研制羊布氏菌疫苗弱毒菌株特有抗原成分單抗，先分析強弱菌株各種抗原成分，找出抗原，然后通過親和層析法分離純化抗原用于免疫和篩檢。但是，研制不同型口蹄疫病毒12s抗原的群特異性單抗時，就不采取先分離群特異性抗原的技術路線，而是用一個型(A型)口蹄疫病毒12s抗原作免疫抗原，用另一個型(O型)口蹄疫病毒12s抗原作篩檢抗原，獲得成功。免疫抗原用鼠組織毒制備，不必精提，因為鼠源雜蛋白與Ballb/c動物是同種，應屬弱抗原，顯然，后者的技術路線比前者的簡便得多。

2.4.2免疫免疫的目的是為了獲得分泌特異性抗體的雜交瘤細胞，并使B細胞在抗原刺激下分化，易于細胞融合，通常選用與骨髓瘤細胞系同系動物進行免疫。如用動物骨髓瘤細胞系，則選用2～3月齡的Ball/c動物;如用大鼠骨髓瘤細胞系則選用Lou/c大鼠。采用什么樣的免疫程序取決于具體抗原性狀和免疫對象以及要制備什么樣性質的單抗而定。但在多數情況下都是參照制備抗血清的常規免疫方法?；A免疫，如病毒抗原多用福氏腹腔注射無佐劑抗原。一般認為最后加強免疫采用靜脈途徑比腹腔好。具體方法:如制備口蹄疫病毒單抗，用福氏完全佐劑抗原，腹腔接種于Balb/c動物，每只20～30μg抗原，4～6周后用同樣劑量的無佐劑抗原靜脈注射，之后第3天取脾融合。用活毒免疫，方法簡便，易獲得IgM類中和單抗。如研制口蹄疫病毒單抗時所采用的活毒免疫法為:100LD50的O型口蹄疫病毒活毒，用適當劑量(接種待免疫的同齡動物至致死率為10%左右)，腹腔接種90日齡Balb/c動物，之后第7天融合，可獲得高滴度IgM類中和單抗。

此外，也有用其他動物的免疫脾細胞與動物骨髓瘤細胞融合，制備異源雜交瘤，生產非鼠源單抗。但這種雜交瘤不夠穩定，染色體易丟失。在免疫方法上，還有把抗原直接注入困難、免疫原性差或對機體有害的抗原用作體外免疫。體外免疫的具體操作方法為:取脾細胞或外周血淋巴細胞制成單細胞懸液，用無血清培養液洗2～3次，然后懸浮于含10%小牛血清的全培養液中，加適量抗原(可溶性抗原一般為0.5～5.0μg/mL，細胞抗原為105～106個/mL)，在37℃，5%～7%CO2箱中培養3～5d，即融合。

2.4.3融合和選擇性培養飼養細胞的制備:在HAT培養液中加入飼養細胞可促進融合后雜交瘤細胞的生長。動物腹腔巨噬細胞、正常脾細胞、胸腺細胞均可作為飼養細胞。由于腹腔巨噬細胞清除死亡的能力強，制備方便，故最為常用。具體操作是:在融合前1～2d，取Balb/c動物3～4只，拉頸致死，浸入75%酒精中消毒體表，然后用大頭針固定在蠟板上，在無菌條件下小心將腹部皮膚剪一小口(切勿剪破腹膜)，剝離皮膚，暴露腹膜，用10mL注射器將5～7mL預冷的無血清培養液注入腹腔，不拔針頭，用彎頭鑷子夾住針眼處的腹膜，固定針頭，封住針口，用另一彎頭鑷子擠壓、揉動腹部約1min，然后吸出注入液體，加入冰浴冷卻的50mL尖底塑料離心管中。1 000r/min離心5～10min，棄上清，用10mL無血清基礎培養液重懸定容，計數細胞;根據需要留取適量細胞懸液，離心棄上清，用HAT培養液重懸，使細胞濃度為1×105～2×105個/mL，加到96孔板中，每孔0.1mL，置37℃ CO2培養箱中待用。也可以在融合當天制備飼養細胞，加入HAT培養液中與融合細胞混合物一起分種于細胞板中?；罴毎嫈捣椒?取0.1mL細胞懸液，加0.9mL 0.4%臺盼藍染液混勻，用血球計數板計數。死細胞為藍色，活細胞不著色。鏡檢時，計數板四角大格內細胞數，壓線者只計上線和右線細胞。

骨髓瘤細胞的培養:維持動物骨髓瘤細胞于最佳生長狀態是融合成功的因素之一。這種細胞倍增時間一般為10～16h，在融合前一周內使其保持對數生長期。剛復蘇的細胞需2周時間才能達到適于融合狀態。融合時需收集2×107個以上骨髓瘤細胞。具體操作為:將細胞培養瓶中液體吸出，加入適量無血清基礎培養液，用彎頭吸管將細胞從瓶壁吹洗下來，用尖底塑料離心管收集細胞懸液，離心沉淀，棄上清，加入10mL無血清培養液重懸，進行活細胞計數?；罴毎麛祽?0%。

為防止在傳代過程中部分骨髓瘤細胞返祖，可用含1～20μg/mL 8-氮鳥嘌呤的完全培養液定期處理骨髓瘤細胞，使其對HAT呈均一敏感性。

免疫脾細胞的制備:取加強免疫后3d的Balb/c動物1～2只，先眶下竇采血，供測抗體用，然后拉頸致死，浸入75%酒精中體表消毒，無菌剝離腹部皮膚，剪開腹膜，取脾，去脂肪和結締組織，放入約含5mL無血清培養液的平皿中的銅網上，用彎頭鑷子擠壓研磨，使細胞分散在液體中，棄渣，離心沉淀，棄上清，加入10mL無血清培養液重懸，按上述方法計數活細胞。

2.4.4細胞融合操作程序融合:按骨髓瘤細胞與脾細胞1∶5的比例取兩種細胞。一般取約2×107個骨髓瘤細胞和108個脾細胞加入50mL尖底塑料離心管中，混勻;以1 000r/min離心10min，棄上清，倒置滅菌濾紙上吸幾次管口殘液，然后用手指彈擊管底，使沉淀細胞團成松散狀，置37℃水杯中預熱;用1mL吸管取0.7mL已在37℃溫箱中預熱的50%PEG(pH8.0)緩緩滴入含混合細胞的離心管中，邊滴邊搖動(離心管不離開水面)，60s內滴完，然后在水中靜置90s;用20mL注射器取15mL預熱的無血清培養液，在2min內向融合管內滴完。開始時慢加，1min后加快，直至滴完。再補加15mL無血清培養液，以1 000r/min離心10min，棄上清，加入40mL含20%小牛血清HAT全培養液，輕輕吹吸幾次，分散細胞，用彎頭滴管分裝于含飼養細胞的4塊96孔板中，每孔0.1mL，蓋蓋，用膠紙(布)固定;將培養板置37℃，5%～7% CO2溫箱中培養。

選擇性培養:融合后用HAT全培養液培養7d后，用HT全培養液對培養板中液體進行半量換液;融合3d后開始鏡檢，觀察是否融合成功，不必天天鏡檢;融合后第3天左右，逐孔鏡檢，標出每孔細胞群總數。當細胞群落已超過顯微鏡1/2視野大時(約培養10d左右)，取上清液供抗體檢測。同時補加HT培養液。去掉A液后，細胞將恢復葉酸代謝途徑。

2.4.5雜交瘤細胞的克隆化融合后必須對陽性孔中雜交瘤細胞進行克隆化，其原因是:融合后陽性孔中的雜交瘤細胞不一定都是目的細胞;一些雜交瘤細胞是不穩定的，可能丟失染色體，喪失產生抗體能力，需不斷清除變異細胞;在液氮中長期保存的雜交瘤細胞也有喪失分泌抗體的可能。所有這些情況說明，需對雜交瘤細胞進行連續克隆化，以純化目的細胞。

最常用的克隆化方法是有限稀釋法，操作步驟如下:提前1～2d向96孔板加動物腹腔巨噬細胞，置CO2培養箱中備用，方法見細胞融合操作程序。待克隆化的陽性融合細胞，達到24孔板擴大培養后再克隆，也可邊擴大邊從96孔板取樣直接克隆。用吸管將細胞群吹打分散，制成懸液，按前述方法精確計數活細胞數。從96孔板直接取樣克隆，計數取樣只用1滴懸液，用另一支滴管加無血清培養液9滴作10倍稀釋，計數。用HT培養液將細胞稀釋至每毫升5、30和50個細胞各40mL;每種雜交瘤細胞用一塊備用的含飼養細胞的96孔板，每個稀釋度32孔，每孔加細胞懸液0.1mL，每孔應含3和5個細胞。由于計數和加樣的誤差，往往偏高或偏低。如從96孔板直接取細胞克隆，應在克隆完后立即把孔中和稀釋管中剩余細胞全部轉入24孔中擴大培養，以備失敗時重新克隆;在37℃5%～7%培養箱中培養7d左右，鏡檢，標出所有板孔的細胞群落數。按融合所述方法采樣，進行抗體檢測。將單克隆陽性的細胞先轉入24孔，后在培養瓶中擴大培養，然后凍存。對于新融合的雜交瘤細胞，一般至少克隆2～3次。對于凍存的克隆細胞株，在復蘇時，最好同時克隆化，以不斷清除變異細胞，保持分泌抗體的穩定性。

2.4.6細胞的凍存和復蘇

凍存液:20%小牛血清，10%二甲基亞砜(DMSO)，70%基礎培養液，混勻，冰浴或冰冷。

凍存方法與步驟:收集處于對數生長期的細胞，離心沉淀，按每毫升5×106～5×107個最終細胞濃度，重懸于凍存液中，按每瓶1mL，分裝于2mL安瓿中，火焰封口，標上細胞名稱、凍存日期，裝入布袋中。將細胞置于泡沫塑料容器內，放入-70℃超低溫冰箱內，次日取出，立即投入液氮罐保存。或將細胞在4℃放置1h，然后移入液氮罐口，每5min下降2cm，在液氮面上停留30min以上，再浸入液氮中。

復蘇方法與步驟:從液氮中取出細胞安瓿，放入37℃水浴中，輕輕搖動，當只剩一點冰塊時，即取出置冰浴上。打開安瓿，將細胞移入含10mL無血清基礎培養液的尖底離心管中，輕輕搖動，離心沉淀，棄上清，用3～4mL全培養液或HT培養液重懸，移入5mL細胞培養瓶中，置37℃，5%～7%CO2溫箱中培養。如鏡檢時死細胞較多，可向培養液中加入最終濃度為104～105個/mL的動物腹腔巨噬細胞。

2.4.8單克隆抗體的生產單抗分體內生產法和細胞培養生產法，在一般實驗室條件下，體內生產法最為常用。

動物體內生產法:將0.5mL液體石蠟或降植烷注入Balb/c動物腹腔;15d后每只動物腹腔接種0.2mL計5×105個細胞，5d后每天觀察動物腹部，當用手觸摸時皮膚有緊張感時，即用16～18#針頭采集腹水，如采2～3次，每只可采5～10mL腹水，抗體含量為1～5mg/mL;離心管去細胞和其他沉淀物，收集上清，測定效價，分裝，-70℃存放。純化前，膜濾或高速離心再次除渣。

細胞生產法:一般實驗室制備單抗常用單層培養法。當細胞密度為1×105～2×106/mL時，上清中的單抗體濃度為10～50μg/mL，所以大量生產單抗必須提高細胞密度。目前用于大量生產的是懸浮培養和細胞固定化培養兩大類。