山東省鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定和血清型分析

摘要：對山東省不同地區送檢的疑似鴨疫里默氏桿菌感染發病的病鴨進行病原菌的分離鑒定。根據培養特性和生化鑒定結果分離出26株鴨疫里默氏桿菌；經玻片凝集試驗和瓊脂擴散試驗得出血清1型10株，血清2型9株，血清6型2株，血清10型2株，還有3株未定型；人工感染試驗表明，分離菌株對櫻桃谷鴨有很強的致病性；藥物敏感試驗表明，分離菌株耐藥譜廣，對氧氟沙星、鹽酸恩諾沙星和氟苯尼考較為敏感。

關鍵詞：鴨疫里默氏桿菌；血清型；藥敏試驗

中圖分類號：S858.324.43 文獻標識號：A 文章編號：1001—4942(2010)12—0092—03

鴨疫里默氏桿菌是危害世界各國養鴨業最為嚴重的傳染病之一，給養鴨業造成了巨大的經濟損失。中國是世界養鴨第一大國，而山東省又是中國第一養鴨大省。最近幾年，山東省農業科學院家禽研究所針對山東省不同地區送檢的疑似鴨疫里默氏桿菌發病鴨進行了病原菌的分離鑒定和血清型分析，以求了解山東省鴨疫里默氏桿菌的臨床發病狀況和主要流行血清型，并對分離菌進行了藥敏試驗，以期篩選出針對該病原菌較敏感的藥物，達到臨床有效治療的目的。

1 材料與方法

1.1 培養基

SA培養基、TsB培養基和麥康凱培養基：購自青島海博公司；細菌生化試驗所用微量發酵管：上海醫學化驗所產品。

1.2 病原菌的分離

無菌條件下取病死鴨的腦、心血、肝臟、肺等病料，接種于加有5％犢牛血清的TSA培養基，放CO₂培養箱37℃培養48h。挑取單個菌落接種新的TSA培養基作進一步純培養，同時將純培養菌接種麥康凱培養基，對純培養菌進行革蘭氏和瑞氏染色，鏡檢觀察形態。

1.3 生理生化特性試驗

常規生化試驗采用微量發酵管(添加10％小牛血清，置37℃，觀察7d)，按程安春等(1997)、王明俊(1997)方法進行。

1.4 細菌玻片凝集試驗

取潔凈載玻片一張，滴蒸餾水一滴，用接種環蘸取待檢菌的純培養物少許，于蒸餾水中混勻，滴加未稀釋的陽性血清一滴。將載玻片輕輕反復擺動，或用接種環涂開，同時觀察結果，幾秒鐘后，出現清晰的乳白色絮狀凝集塊者，即為凝集反應陽性。

1.5 瓊脂擴散沉淀試驗

將NaCl和瓊脂糖按一定比例混合，用蒸餾水溶解，水煮融化，傾于平板上，使厚度達到2～3mm，待冷卻后用梅花打孔器打孔，即中央1個孔，周圍6個孔。血清加在中央孔，抗原加在外圍孔。將孔加滿，置濕盒，37℃溫箱中過夜后，判讀結果。出現清晰沉淀線者，記錄為陽性。

1.6 人工感染試驗

參照王明俊(1997)方法將確定血清型的分離菌經純化后，四種血清型各選一株菌(分別為SD-01，SD-02，SD-08，SD-17)接種于加有5％犢牛血清的TSB液體培養基，37℃振蕩培養24h后純檢，細菌比濁計數，活菌含量約為1.0×10⁹CFU／ml。取未免疫過鴨疫里默氏桿菌滅活疫苗的14日齡健康櫻桃谷鴨100羽，分成5組，試驗組4組，每組為20羽，對照組為20羽。試驗組以分離菌純培養物0.1ml／羽接種，含菌數為1.0×10⁸CFU，第5組不接種菌。接菌后觀察10d，記錄發病和死亡情況。

1.7 細菌的藥物敏感試驗

參照程安春等(1997)介紹方法進行。選擇15種臨床常見抗菌藥物的藥敏試紙片，在加有5％犢牛血清的TSA瓊脂平板上采用藥敏紙片擴散法進行，于CO₂培養箱37℃培養24h，觀察結果。藥物抑菌圈直徑>20mm為高敏；15～20mm為中敏，5～15mm為低敏，≤5mm為不敏感。

2 結果與分析

2.1 細菌分離

結果表明，TSA瓊脂平板培養基上見有細菌生長，菌落濕潤，露滴樣。而麥康凱瓊脂平板上未見細菌生長。取TSA瓊脂平板上菌落進行純培養，革蘭氏染色為陰性的短小桿菌，瑞氏染色法染色、鏡檢，可見菌體兩極濃染。共分離出26株菌，依次命名為SD01、SD02、…、SD26。

2.2 生化試驗

分離菌均對葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、山梨醇等碳水化合物不發酵，靛基質試驗、甲基紅試驗、尿素酶試驗和硝酸鹽還原試驗均為陰性，不產生硫化氫，液化明膠，過氧化氫酶陽性。

2.3 血清型判定

將分離到的26株菌分別與標準陽性血清進行細菌凝集試驗和瓊脂擴散試驗。兩種試驗結果判定一致：分離菌SD01、SD03、SD05、SD09、SD11、SD12、SD15、SD21、SD22、SD26共10株，均與抗鴨疫里默氏桿菌1型陽性血清發生凝集反應；分離菌SD02、SD04、SD06、SD07、SD10、SD13、SD16、SD18、SD23共9株，均與抗鴨疫里默氏桿菌2型陽性血清發生凝集反應；剩余7組分離菌SD08、SD14、SD17、SD19、SD20、SD24、SD25與抗鴨疫里默氏桿菌1、2型血清均不發生凝集反應。將未與1、2型標準陽性血清發生凝集反應的菌株送到中國農業大學鑒定，SD08、SD14為6型鴨疫里默氏桿菌，SD17、SD19為10型鴨疫里默氏桿菌，SD20、SD24、SD25為未定型鴨疫里默氏桿菌。具體結果見表1。

2.4 人工感染試驗

試驗組櫻桃谷鴨接菌后24h開始出現癥狀，致死鴨均表現出“三炎”病變，并對死亡鴨進行細菌分離，結果重新分離到接種菌，并能凝集相應血清型的鴨疫里默氏桿菌。而對照鴨均健存。各組的致死率見表2。

2.5 對抗菌藥物的敏感性

選用常規藥敏試紙片對分離菌進行紙片法藥敏試驗，結果(表3)表明，病原菌分離株耐藥譜較廣，但對氧氟沙星、鹽酸恩諾沙星和氟苯尼考較為敏感。

3 討論

鴨疫里默氏菌病是嚴重危害全世界養鴨業的一種細菌性傳染病，尤其在我國的肉鴨養殖場中較為普遍。據國外報道主要血清型有21個，近年來國內學者對我國主要血清型的存在也有陸續報道。筆者從表現為明顯的鴨疫里默氏菌病的臨床癥狀與病理變化的山東鴨場的病鴨中，分離出26株菌經革蘭氏染色觀察到陰性的短小桿菌，細菌凝集時，分別與1、2、6、10型標準血清發生陽性凝集反應，瓊脂糖擴增時出現清晰沉淀反應，從而可鑒定為1、2、6、10型鴨疫里默氏菌。從分離菌的血清型鑒定可知，山東省目前主要流行血清型為1、2型，其1、2型分離率接近80％。分離株的致病性試驗表明，1、2型菌株對櫻桃谷鴨有很強的致病性。對山東部分鴨場調查發現，鴨疫里默氏桿菌已經是引起雛鴨發病的主要病因，有的鴨場雛鴨的發病率和死亡率分別達40％和30％，而且常規藥物治療效果不明顯。這可能與藥物不合理使用有關，藥敏試驗結果推薦使用氧氟沙星、鹽酸恩諾沙星、氟苯尼考，防治效果較好。因此建議臨床上用藥前進行系列藥敏試驗，以規范用藥，達到良好的治療效果。