龍葵SorMT2a和SorMT2c基因的克隆及其轉(zhuǎn)化煙草研究

摘要：以龍葵為試驗材料，利用RT-PCR技術分離到2個長度不同的編碼Ⅱ類MT(金屬硫蛋白)的CDNA克隆SorMT2a(EU760481)和SorMT2c(EU760483)，成功構(gòu)建植物表達載體pROKⅡ-SorMT2a和pROKⅡ-SorMT2c，通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化煙草并通過PCR驗證了基因的表達情況。與野生植株相比，轉(zhuǎn)SorMT2a和SorMT2c基因煙草對鎘的耐受性不同，有的轉(zhuǎn)SorMT2a基因植株在MS培養(yǎng)基中的CdCl2濃度達到200μmol／L時仍然生長良好，生物量和株高均大于野生型植株；而轉(zhuǎn)SorMT2c基因植株對鎘的耐受性沒有提高。這說明SorMT2a基因在植物對鎘的耐受性中起作用，而SorMT2c基因則不起作用，從而也說明了同一類基因不同家族可能具有不同功能。

關鍵詞：龍葵；金屬硫蛋白；重金屬；RT-PCR；SorMT2a；SorMT2c

中圖分類號：Q785；Q949.777.7 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942(2010)12-0001-05

金屬硫蛋白(Metallothionein，MT)是一類富含半胱氨酸、不含組氨酸和芳香族氨基酸、無二硫鍵的小分子細胞內(nèi)金屬結(jié)合蛋白，在重金屬解毒和重金屬穩(wěn)態(tài)維持中具有重要作用，是首次從馬的腎臟中分離出來并命名的。植物金屬硫蛋白的發(fā)現(xiàn)相對較晚，目前已分離純化的植物金屬硫蛋白只有小麥Ec蛋白和擬南芥的MT1、MT2和MT3。很多研究表明，MT mRNA的累積量與某些金屬離子的誘導呈正相關。迄今為止，在擬南芥、水稻、小麥、大豆、棉花、玉米、番茄、辣椒、馬鈴薯等植物中均克隆到了MT基因cDNA或基因組序列。轉(zhuǎn)小鼠MT的煙草中，接近20％的植株可以在200μmol／L鎘下正常生長，而對照野生煙草在10μmol／L鎘下生長便受到嚴重抑制。將麥瓶草的MThis轉(zhuǎn)到煙草中，提高了其根和葉對鎘的積累量。

龍葵(Solanum nigrum L)屬茄科茄屬龍葵亞屬植物，是我國新近發(fā)現(xiàn)的一種重金屬鎘超積累植物。近年來，人們對龍葵的研究主要集中在鎘耐受性和生理特性方面，而對與龍葵鎘耐受有關的基因——金屬硫蛋白基因的克隆和研究，目前尚未見報道。本研究經(jīng)同源克隆獲得了龍葵2個長度不同的Ⅱ類金屬硫蛋白基因的cDNA序列SorMT2a和SorMT2c，并將其轉(zhuǎn)到煙草中，分析了其對植物鎘耐受性的作用，為研究龍葵MT基因的功能奠定了基礎，并為運用植物修復技術清除土壤中的鎘提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物和菌株：龍葵和煙草種子由山東省農(nóng)業(yè)科學院高新技術研究中心提供?？寺≥d體pMD18-T Vector購自TAKARA公司。大腸桿菌DH5a、農(nóng)桿菌LBA4404及植物表達載體pROKⅡ由山東省農(nóng)業(yè)科學院高新技術研究中心保存。

主要工具酶及試劑盒：總RNA抽提試劑盒(北京GenStar)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransGen Bio-tech)、DNA凝膠回收試劑盒(北京百泰克)、質(zhì)粒提取試劑盒(北京百泰克)、限制性內(nèi)切酶Xba I和kpn I及連接酶T4 DNA Ligase(TAKARA)、Taq DNA Polymerase(Fermentas)等。

1.2 方法

1.2.1 龍葵MT cDNA的克隆登錄GenBank數(shù)據(jù)庫，根據(jù)公布的番茄等Ⅱ類MT氨基酸和基因保守序列，設計了兩對簡并引物：(1)P1-F：5′-ATGTCKTGCTGTGGAARCTG-3′P1一R：5′-CTACTTAGARCAAGTGCAAGGGTF-3；(2)P2-F：5′-ATGTCKTGCTGTGGAARCTG-3′，P2-R：5′-CTARCARKTGCAAGGGTCRCAYKT-3′。以龍葵總RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成CD-NA。以合成的單鏈eDNA為模板，通過RT-PCR方法擴增龍葵MT基因，反應程序為：94℃，5min；94℃，1min.52℃，1min，72℃，1min，34個循環(huán)；72℃，5min。擴增結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳后，切下目的基因片段，DNA凝膠提取試劑盒進行回收。調(diào)制連接反應液(10μl體系)，16℃連接3h，連接到pMD18-T Vector上。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，用藍白斑法篩選轉(zhuǎn)化子，對白色菌落進行菌液PCR驗證。將可擴增出目的條帶的陽性菌液送上海生物工程技術公司測序。

1.2.2 轉(zhuǎn)龍葵MT2煙草及鎘耐受性分析 根據(jù)SorMT2和pROKⅡ(圖1)的多克隆位點(MultipleCloning Site，MCS)核苷酸序列，設計了如下2對引物，分別擴增SorMT2a和SorMT2c的ORF：P3-F：5′-GCtcgaATGTCTTGCTGTGG-3′和P3-R：5′-GgggtaccCTACTFAGAGCAAG′，P4-F：5′-GCtctagaATGTCq'TGCTGTGG′和P4-R：5′-GgggtaccCTAACAATTGCAAG′，其中的小寫字母分別表示Xba I和Kpn I的酶切位點。

根據(jù)載體序列，設計了一對引物(位于載體MCS兩側(cè))：pROKⅡ-C657：5′-GTAACGC-CAGGGTITFCCCAG-3′，pROKⅡ-C834：5′-GACCCTrCCTCTATATAAGG-3′(35S promoter)。分別以測序正確的質(zhì)粒pMD18-SorMT2a、pMD18-SorMT2c為模板，P3-F、P3-R及P4-F、P4-R為引物進行PCR，特異性擴增目的基因SorMT2a和SorMT2c。將擴出的目的基因連到T載體上，并進行測序，然后將測序正確的質(zhì)粒用Xba I和Kpn I進行雙酶切，回收酶切產(chǎn)物，將其與同樣雙酶切的植物表達載體pROKⅡ連接，然后通過卡那霉素抗性篩選出陽性克隆，提取質(zhì)粒，進行PCR驗證，將驗證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)到農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細胞中。

用農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化煙草，參照Homh等的方法并有所修改：取無菌培養(yǎng)瓶中煙草葉片，剪成邊長約為0.5cm的小方塊，用含有SorMT2a和SorMT2c表達載體的農(nóng)桿菌菌液浸泡1.5min，期間不時輕輕晃動；取出侵染的葉片，用無菌濾紙吸干，然后將其放入MS分化培養(yǎng)基(MS+1mg／L6-BA+0.1 mg／LNAA)上28℃暗培養(yǎng)2d；經(jīng)共培養(yǎng)的葉片再轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基(MS+150mg／L卡那霉素+300mg／L頭孢霉素)上進行選擇培養(yǎng)，每兩周繼代一次；待抗性芽長到1cm以上時，切下小芽并切除芽基部的愈傷組織，轉(zhuǎn)移到MS生長培養(yǎng)基上；待植株長到2～3cm時，轉(zhuǎn)到1／2MS生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。

CTAB法提取煙草葉片總DNA，以總DNA為模板進行PCR鑒定，其中，檢測轉(zhuǎn)空載體pROKⅡ和轉(zhuǎn)SorMT2a、SorMT2c基因植株的引物對分別為一對卡那抗性引物、pROKⅡ-C834和P3-R、P4-F和P4-R。按下列程序進行反應：94℃，5min；94℃，45s，55℃，45s，72℃，1min，34個循環(huán)；72℃，5min。擴增結(jié)束后，1％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

各取15株轉(zhuǎn)基因煙草株系，切莖段，插入含有不同濃度(0、100、200、400μmol／L)CdCl的MS培養(yǎng)基中，生長30天后，觀察其生長情況并測定生物量和葉綠素含量，進行初步的鎘耐受性試驗。利用SAS(8.2)軟件，通過AVOVA統(tǒng)計分析檢測生理指標的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的序列測定

將鑒定的陽性克隆送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，并用DNAStar生物軟件去除載體序列，結(jié)果顯示獲得的基因長度分別為249bp(SorMT2a)和234 bp(SorMT2c)，在GenBank上的登錄號分別為EU760481和EU760483。

2.2 PCR鑒定轉(zhuǎn)SorMT2a和SorMT2c煙草株系

以轉(zhuǎn)基因和野生型煙草植株的基因組DNA為模板進行PCR鑒定，結(jié)果顯示，質(zhì)粒pROKⅡ、陽性質(zhì)粒pROKⅡ-SorMT2a、陽性質(zhì)粒pROKⅡ-SorMT2c和轉(zhuǎn)基因株系均出現(xiàn)與插入片段大小相符的條帶，而野生型植株和水對照則無目的條帶(圖2～4)，初步證明質(zhì)粒pROKⅡ和攜帶目的基因SorMT2a和SorMT-2c的質(zhì)粒pROKⅡ-SorMT2a、pROKⅡ-SorMT2c均插入到煙草植株中。

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草植株的鎘耐受性分析

從圖5可以看出，隨著CdCl₂濃度的升高，野生型和各轉(zhuǎn)基因煙草植株的生物量均呈現(xiàn)下降趨勢，但轉(zhuǎn)基因煙草生物量下降得較緩慢。鎘濃度為100μmol／L時，轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草生物量差異不明顯。在CdCl₂濃度升高到200μmol／L時，野生型總生物量下降了75.05％，而轉(zhuǎn)SorMT2a基因植株總生物量下降41.40％，較野生型少33.65個百分點，差異極顯著，受Cd毒害最輕；轉(zhuǎn)SorMT2c基因總生物量下降63.26％，較野生型少11.79個百分點，差異也達到極顯著水平，受Cd²⁺毒害也較輕。

由圖6可以看出，隨著CdCl濃度的增加，煙草植株葉綠素含量逐漸減少，植物的光系統(tǒng)受到了破壞；在CdCl濃度為200μmol／L時，四種煙草株系葉綠素含量分別下降了54.06％、17.34％、54.56％和54.21％，轉(zhuǎn)SorMT2a基因植株光系統(tǒng)受到的破壞比較小。

3 討論

在對轉(zhuǎn)基因植株進行PCR鑒定時發(fā)現(xiàn)，在含抗生素的培養(yǎng)基上篩選得到的植株PCR鑒定基本都為陽性。說明本試驗設計比較合理，適合煙草轉(zhuǎn)化，但在轉(zhuǎn)基因的過程中發(fā)現(xiàn)愈傷組織呈現(xiàn)黃色，與以往報道的愈傷組織呈現(xiàn)綠色的結(jié)果不同，這可能與載體有一定的關系。

試驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)SorMT2a基因植株對Cd²⁺的耐性可達200μmol／L，可以初步推測SorMT2a基因在解除植物的Cd²⁺毒性中發(fā)揮一定作用；而SorMT2c基因可能在植物對鎘的耐受性中不起作用。這可能是該基因家族豐富性的一個原因，即不同的金屬硫蛋白基因在植物的生長發(fā)育過程中執(zhí)行不同的功能，發(fā)揮不同的作用。Quan等從花生(Arachis hypogaea L)中克隆到7個金屬硫蛋白基因，并把AhMt2a轉(zhuǎn)入擬南芥中，發(fā)現(xiàn)過量表達該基因的擬南芥對Cd²⁺的耐受性明顯增強，與本研究結(jié)果一致。

龍葵MT基因轉(zhuǎn)入煙草后提高其對重金屬鎘的耐受性機理尚不清楚，MT基因的插入是否導致某些基因失活；MT除了與Cd²⁺形成結(jié)合態(tài)鎘外，是否還有其他解毒方式和功能；MT與Cd²⁺的確切關系如何等，都有待于進一步深入研究。另外，深入研究龍葵MT基因的基因組結(jié)構(gòu)及順式作用元件和反式作用因子，通過轉(zhuǎn)基因技術調(diào)控龍葵MT基因的表達、分離篩選突變體等工作，都是未來鎘超積累植物龍葵研究的重要課題。