分子技術在食品乳酸菌分類和鑒定中的應用

摘要:近年來，乳酸菌的各種菌株用于多種食品和益生產品。由于乳酸菌的益生功效為菌株依賴性，而單純采用表型鑒定方法都無法準確鑒別到種屬水平。而基于DNA的基因型鑒定技術，因其檢測的準確、穩定和靈敏可以實現乳酸菌種屬甚至菌株水平的分類和鑒別。本文對目前的主要分子技術在乳酸菌菌株分類和鑒定中的應用做一綜述。

關鍵詞:

乳酸菌;益生菌;鑒定;食品;分子技術

中圖分類號:TQ

文獻標識碼:A

文章編號:1672-3198(2010)16-0321-02

隨著人們生活品質的提高，人們廣泛關注益生菌食品。益生菌是指一類活的，攝入足夠量就可以通過改善腸道微生態平衡而促進人體健康的微生物。目前益生菌中應用較多的是乳桿菌和雙歧桿菌。益生菌功效主要集中在維持和調節機體的正常腸道菌群上并由此產生一系列的益生作用，但其益生功效為菌株依賴性。由中國疾控中心營養與食品安全所牽頭的研究結果證實，含有B益暢菌(即雙歧桿菌DN173010)的酸奶能縮短腸道傳輸時間，對腸易激綜合征人群、便秘人群的胃腸道有明顯的改善效果。由于不同菌株改善腸道的機制不同，所以對乳酸菌在菌株水平的鑒定就至關重要。傳統的表型法鑒定主要建立在形態學及生理生化特征基礎上，但因其種間生化性狀相似，單純使用該法往往無法準確區分各個種。隨著分子標記技術的發展，基因型鑒定法以核酸為檢測對象，因其更加靈敏和準確而被國內外學者用于乳酸菌的鑒定。

1 乳酸菌

乳酸菌是存在于人體內的益身菌。按照生化分類法，用于食品中乳酸菌分為5個屬:乳稈菌屬、雙歧桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬(Leuconostoc)和汁球菌屬，每個屬包括多種菌種，某些菌種還包括數個亞種。目前益生菌產品中應用較多的是乳桿菌屬(Lactobacillaceae L)和雙歧桿菌屬(Bifidobacteria B)。乳桿菌屬中同型發酵乳稈菌包括:德氏乳桿菌(L.delbrueckii)、保加利亞乳桿菌(L.bulgaricus)、瑞士乳稈菌(L.helveticus)、嗜酸乳稈菌(L.acidophilus)和干酪乳桿菌(L.casei);異型發酵乳桿菌包括:短乳稈菌(L.brevis)和發酵乳桿菌(L.fermentum)，主要用于發酵工業。雙歧桿菌屬目前已知的雙歧稈菌有24種，而應用于發酵乳制品生產的僅有5種包括:兩歧雙歧稈菌(B.bifidum)、長雙歧桿菌(B.longum)、短雙歧稈菌(B.breve)、嬰兒雙歧稈菌(B.infantis)和青春雙歧桿菌(B.adolescentis)，它們都存在于人的腸道內。2001年我國衛生部公布的可用于保健食品的益生菌菌種包括:B.bifidum、B.infantis、B.longum、B.breve、B.adolescentis、L.bulgaricus、L.acidophilus、干酪乳桿菌干酪亞種(L.Casei subsp.casei)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)。而國外用于酸奶及微生物制劑的主要乳酸菌種包括:L.acidophilus、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)、羅氏乳桿菌(L.rogosae)、植物乳桿菌(L.plantarum)、L.casei、詹氏乳桿菌(L.jensenii)、B.breve、B.longum、B.bifidum等。

2 乳酸菌的鑒定方法

2.1 表型鑒定法

傳統上對乳酸菌屬的鑒定主要根據菌體成分或代謝產物在同種屬間存在的差異，通過測定這些成分的含量進行菌種鑒定，如:乳酸旋光性的測定、乳酸菌含有的醌分析、細胞壁肽聚糖組分和結構分析。這種基于表面受體的特異性和生化特性的檢測方法為表型特征鑒定法。由于該方法無法顯示菌體基因組信息，不能體現鑒別菌株間的親緣關系，且其方法自身檢測的模糊性，分辨率不高，重復性差，且結果受微生物生長條件的影響等缺點，基于表型特征的培養鑒定方法無法對乳酸菌進行準確的屬或者種甚至菌株水平的鑒定。

2.2 基因型鑒定法

近年來，學者們采用新的分子生物學和分子標記技術迅速而準確的在亞種和菌株水平上對乳酸菌進行鑒別和分類。這種根據菌株之間遺傳距離而導致的DNA指紋差異;從分子和基因水平研究和鑒定乳酸菌遺傳結構、組成和分類的方法為基因特征鑒定法。這種以DNA為基礎的主要檢測技術有:隨機擴增多態性DNA (randomly amplified polymorphic DNARAPD)指紋圖譜、限制性片段長度多態性(restriction fragment length polymorphismRFLP)、擴增片段長度多態性 (Amplification fragment length polymorphismAFLP)、脈沖瓊脂凝膠電泳(Pulse field gelelectrophoresisPFGE)、擴增性rDNA限制性酶切片段分析(amplified ribosomal DNA restriction analysis，ARDRA)。

2.2.1 16SrDNA/rRNA序列分析:從屬到種的鑒定

對生物大分子演變的研究是研究物種的近緣關系的很好工具。16S rDNA或16S rRNA既具有保守性，又具有高變性，為細菌多態性研究最常用的靶基因。Sul等依據L.acidophilus、L.rhamnosus、B.longum、B.bifidum四種菌的16S rRNA、23S rRNA和16S-23S間區設計引物，快速準確的在屬和種水平對四種乳酸菌進行鑒定。

2.2.2 脈沖瓊脂凝膠電泳(PFGE)

PFGE可用于乳酸菌的培養鑒定，乳酸菌包埋于瓊脂塊中，用適當的內切酶在原位對整個染色體進行酶切，酶切片段在特定的電泳系統中通過電場方向不斷交替變換及合適的脈沖時間等條件下而得到良好的分離。PFGE中內切酶的選用至關重要，所采用的內切酶常為寡切點酶(low frequency cleavagerestric-tionendoucleases)，這種酶切后的片段少而大，適合于作PFGE電泳。該方法是在全基因組水平的分析，能對菌株的突變進行檢測(DNA缺失，插入或重組)，分辨率高。已有多位學者利用該技術進行中水平的鑒別:B longum和B.animalis;L casei 和 L.rhamnosus;Lacidophilus 和L.helveticus;Lb.johnsonii。

2.2.3 隨機擴增多態性DNA指紋圖譜 (RAPD) 

RAPD技術是1990年由Wiliam和Welsh等人利用PCR技術發展的檢測DNA多態性的方法。利用隨機引物(一般為8—10bp)通過PCR反應非定點擴增DNA片段，然后用凝膠電泳分析擴增產物DNA片段的多態性。擴增片段多態性便反映了基因組相應區域的DNA多態性。RAPD可用于對整個基因組DNA進行多態性檢測，也可用于構建基因組指紋圖譜，具有種屬甚至種間特異性。與RFLP相比，RAPD技術簡單，檢測速度快;分析只需少量DNA樣品且一套引物可用于不同生物基因組分析。但是，由于該方法存在共遷移問題且該技術影響因素多，凝膠電泳只能分開不同長度DNA片段，而不能分開那些分子量相同但堿基序列組成不同的DNA片段，實驗的穩定性和重復性差。所以該技術通常與其他技術聯用:Spano G等利用RAPD結合物種特異性PCR技術對紅葡萄酒中L plantarum進行種水平的鑒定。Schillinger U等采用L.casei 和 L.acidophilus的種屬特異性引物，結合RAPD-PCR分析，鑒別出益生菌酸奶中分離的20株乳酸菌，結果與標準菌株圖譜對照，證明此法能實現乳酸菌的菌株水平的鑒別。

2.2.4 限制性片段長度多態性(RFLP)

1974年Grodzicker等創立了限制性片段長度多態性(RFLP)技術，它是一種以DNA—DNA雜交為基礎的第一代遺傳標記。采用特定的限制性內切酶識別并切割不同生物個體的基因組DNA，得到大小不等的DNA片段，所產生的DNA數目和各個片段的長度反映了DNA分子上不同酶切位點的分布情況。通過凝膠電泳分析這些片段，就形成不同帶，然后與克隆DNA探針進行Southern雜交和放射顯影，即獲得反映個體特異性的RFLP圖譜。它所代表的是基因組DNA在限制性內切酶消化后產生片段在長度上差異。該技術用于乳酸菌菌株種內水平鑒定的DNA指紋法。Randazzo CL等結合PCR和RFLP技術從自然發酵的橄欖油中分離的35個同型發酵乳桿菌菌株中，分離出24個L casei，11 L plantarum.。該方法具有RFLP標記位點數量不受限制的特點，但是克隆可表現基因組DNA多態性的探針較為困難;另外，該方法操作繁鎖，且檢測周期長檢測成本高。

2.2.5 擴增片段長度多態性 (AFLP)

AFLP是1993年荷蘭科學家Zbaeau和Vos發展起來的一種檢測DN A多態性的新方法。AFLP 是 RFLP 與PCR相結合的產物，其基本原理是先利用限制性內切酶水解基因組 DNA 產生不同大小的 DNA 片段，再使雙鏈人工接頭的酶切片段相邊接，作為擴增反應的模板 DNA，然后以人工接頭的互補鏈為引物進行預擴增，最后在接頭互補鏈的基礎上添加 1~3個選擇性核苷酸作引物對模板 DNA 基因再進行選擇性擴增，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳分離檢測獲得的DNA擴增片段，根據擴增片段長度的不同檢測出多態性。該技術的獨特之處在于所用的專用引物可在知道 DNA 信息的前提下就可對酶切片段進行PCR 擴增。為使酶切濃度大小分布均勻，一般采用兩個限制性內切酶，一個酶為多切點，另一個酶切點數較少，因而 AFLP 分析產生的主要是由兩個酶共同酶切的片段。AFLP 結合了 RFLP 和 RAPD兩種技術的優點，具有分辨率高、穩定性好、效率高的優點。Giorgio G等采用該技術對種族遺傳學上關系密切的菌種進行物種水平的鑒定。利用該技術遺傳多樣性的結果可以對種質進行聚類分析，Giorgio G等應用該法了解L pentosus，、L.plantarum和 L.pseudoplantarum乳酸菌菌屬的系統發育與親緣關系。但其技術費用昂貴，對 DNA 的純度和內切酶的質量要求很高。盡管 AFLP 技術誕生時間較短，但可稱之為分子標記技術的又一次重大突破，被認為是目前一種十分理想、有效的分子標記。

3 結論

酸菌的各種菌株已廣泛應用于各種益生菌產品和食品中，表型生化鑒定法耗時耗力，且培養和生化鑒定結果易受到培養條件等諸多因素的影響，且主要缺點在于無法反應菌株的核酸信息。基因型鑒定法準確、快速、靈敏，且分辨率高。但是由于每種方法基于的原理不同和各種檢測方法的優勢不同，各種方法都一定的選擇性和局限性。目前，還沒有一種方法能單獨完成各種物種各種水平的檢測。所以，只有聯合各種鑒別方法，充分利用各種方法的優勢，且聯合表型特征鑒定法和基因特征鑒定法，才能得到更為便捷、準確和靈敏的乳酸菌的分類和鑒別。

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