三七總皂苷對快速老化SAMP8小鼠PI3K/Akt和PLCγ1/PKC信號通路的影響*

陳文兵 田新 吳登攀 鐘振國 黃金蘭

(1. 徐州醫科大學藥學院，江蘇 徐州 221004；2. 廣西中醫藥大學科學實驗中心，廣西 南寧 530200)

老年癡呆(Senile dementia，SD)是老年期發生的以記憶障礙、失語、失認、失用和行為改變為主要臨床特征的一類疾病，包括阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)、血管性癡呆(Vascular dementia，VD)，混合型癡呆(Mixed dementia)和其他類型癡呆(Other dementia)，其中AD是該類疾病的主要類型[1-4]。現代醫學認為SD是多因素引起的一種原發性大腦神經退行性病變，患者海馬神經元缺失而認知能力下降。 PI3K/Akt是抑制細胞凋亡和促進細胞存活的重要信號通路，激活PI3K/Akt信號通路可發揮神經保護作用[5-6]。PLCγ1被認為是一個與細胞增殖和分化有重要關系的分子，廣泛分布于中樞神經系統，PLCγ1催化分解的1，2一二酞基甘油(DAG)產物可激活PKC，PKC活化與細胞的增殖、分化、凋亡等多種生物學效應有密切關系[7]。三七總皂苷(PNS)是三七的活性成分，前期研究顯示PNS具有明顯改善快速老化癡呆模型小鼠SAMP8(以下簡稱SAMP8)的學習記憶能力[8]，然而，其機制尚不清楚。本研究擬探討PNS對PI3K/Akt和PLCγ1/PKC信號通路的影響，以期為PNS治療SD提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取3月齡雄性SAMP8 30只，體重20～30 g；SAMR1小鼠(與SAMP8同一來源陰性鼠，3月齡)10只，均由中國醫學科學院實驗動物研究所提供[動物合格證號：SCXK (京)2014-004]。實驗動物飼養在SPF級動物房內。實驗方案經徐州醫科大學實驗動物道德倫理委員會批準。

1.2 實驗儀器 Light Cycle 480熒光定量 PCR 儀(Roche公司)；NanoDrop 1000核酸濃度測定儀(Thermo Scientific 公司)；Elx 808酶標儀(BioTek公司)；VE 180 Tanon 垂直電泳系統(上海天能科技有限公司)；半干轉印系統(Bio-Rad公司)；V37掃描儀(EPSON 公司)；BX43F正置熒光顯微鏡(OLYMPUS 公司)。生物組織自動脫水機、包埋機、切片機(金華科迪儀器設備有限公司)。

1.3 實驗藥品與主要試劑 三七總皂苷(PNS，云南云科藥業有限公司，批號：140115)；IRDye 800CW goat anti-rabbit TgG (Li-cor公司，貨號：926-32211)；ReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo公司，貨號：FSQ-101)；TRIzol? Reagent (Life Technologies公司，貨號：15596-026)；PI3K抗體(Santa Cruz公司，貨號：sc-292114)；p-Akt抗體(Cell Signaling 公司，貨號：4060S)；Akt抗體( Cell Signaling 公司，貨號：4691S)；β-actin 抗體(Bioworld 公司，貨號：AP0060)；p-PLCγ1抗體(Cell Signaling 公司，貨號：14008S)；PLCγ1抗體(Cell Signaling 公司，貨號：5690S)；尼氏(Nissl)染色液(Beyotime，C0117)；PKC Kinase Activity Assay Kit (abcam公司，貨號：ab139437)。

1.4 方法

1.4.1 動物分組與給藥 SAMP8小鼠隨機分為模型組、PNS高劑量組(200 mg·kg-1)和PNS低劑量組(100 mg·kg-1)，每組10只。藥物組每日給予藥物灌胃一次，對照組(SAMR1組)和模型組每日給予相同體積的生理鹽水，連續給藥2個月。

1.4.2 尼氏染色法觀察海馬形態 大腦組織灌注后浸于4%多聚甲醛48 h，脫水、石蠟包埋，切片常規脫蠟至水化，置入尼氏染色液10 min，自來水沖洗，二甲苯透明，中性樹膠封片。染色切片在光學顯微鏡下隨機選取5個視野拍片，觀察海馬CA1區錐體細胞形態。

1.4.3 酶活性試劑盒檢測PKC的活性 采用 Kinase Activity Assay Kit試劑盒檢測大腦PKC的活性，具體操作嚴格按照試劑盒說明進行。取新鮮大腦組織，加入RIPA裂解液于冰上充分裂解后，低溫離心取上清，BCA法檢測樣本的蛋白濃度。PKC 孔板每孔加入50 μL 激酶溶液，放置10 min后棄液，每孔加入含2 ug樣本質量的激酶溶液，再加入10 μL/孔ATP，封膜30℃恒溫孵育90 min。棄液，加入40 μL/孔磷酸化底物抗體常溫孵育60 min后，洗滌4次，加入40 μL/孔辣根過氧化物常溫孵育30 min后再洗滌4次，加入60 μL/孔TMB底物常溫孵育50 min后加入終止液，于450 nm波長處測定各孔的吸光度，按公式計算PKC活性。蛋白激酶C的相對活性=(樣本吸光度-空白吸光度)/ 每孔蛋白質量。

1.4.4 實時定量PCR檢測小鼠腦內PI3K、Akt、 PLCγ1和PKC mRNA的含量 采用TRIzol法提取小鼠大腦的RNA，檢測其濃度和純度。按逆轉錄說明書反轉錄成cDNA備用。根據小鼠PI3K、Akt 、PLCγ1和PKC基因序列，由上海生工生物公司設計合成上、下游引物序列(見表1)。在Roche LightCycler? 96熒光定量PCR儀上進行擴增反應。以ACTB為內參，按 2-ΔΔCt法計算各目的基因mRNA的相對表達水平。

1.4.5 免疫印跡法測定PI3K，p-Akt (Ser473)、Akt、p-PLCγ1 (Tyr783)和 PLCγ1 蛋白的表達水平 大腦組織加入適量裂解液，冰浴電動勻漿，4℃，12000 r/min離心10 min，收集上清液，BCA法檢測蛋白濃度。蛋白樣本經SDS-PAGE 電泳、轉膜、5%BSA封閉后，加入一抗(PI3K：1：500，p-Akt：1：2000，Akt：1：1000，p-PLCγ1：1：1000，PLCγ1：1：1000，β-actin：1：2000)4℃搖床上孵育過夜，次日加入熒光二抗(1：10000)孵育1 h，TBS清洗后EPSON掃描儀掃描圖像，用Image J軟件對蛋白條帶進行灰度分析。

2 結果

2.1 海馬CA1區神經元形態觀察 尼氏小體在光學顯微鏡下為嗜堿性深染的顆粒或小塊，分布于神經元胞體和樹突中。經尼氏染色后呈藍紫色。尼氏小體大而數量多，說明神經細胞合成蛋白質的功能較強；相反在神經細胞受到損傷時，尼氏小體的數量會減少甚至消失。對照鼠海馬CA1區錐體細胞數量多，結構完整，排列規整，尼氏小體染色均一，SAMP8海馬CA1區錐體細胞數量減少，排列紊亂，形態不規整，有斷層，尼氏小體細胞數量明顯減少。PNS給藥組CA1區錐體細胞排列整齊形態正常，尼氏著色較均一且數量明顯增多。見圖1。

2.2 PNS對SAMP8腦內PKC活性的影響 與對照組比較，模型組的 PKC活性有所降低，但差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，PNS低、高劑量組的 PKC活性明顯升高，差異有統計學意義(P<0.01)。結果提示，PNS可以提高SAMP8小鼠大腦PKC活性。見圖2。

2.3 PNS對SAMP8腦內PI3K、Akt、PLCγ1和PKC mRNA的含量的影響 與對照組相比，模型組的PI3K、Akt 和PKC mRNA的含量顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，PNS高、低劑量組的PI3K、Akt mRNA表達水平顯著提高(P<0.05)；PNS高劑量組PLCγ1和PKC mRNA表達水平亦顯著增高(P<0.05)。提示PNS可提高SAMP8小鼠腦內PI3K/Akt通路及PLCγ1/PKC通路基因表達。見圖3。

2.4 PNS對SAMP8腦內PI3K，p-Akt (Ser473)、Akt、p-PLCγ1 (Tyr783)和 PLCγ1 蛋白表達的影響 與對照組比較，模型組小鼠腦組織PI3K、p-Akt 和p-PLCγ1蛋白表達顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，PNS高、低劑量組上調SAMP8 小鼠腦組織PI3K、p-Akt和 p-PLCγ1蛋白表達(P<0.01)；各給藥組小鼠腦組織Akt和PLCγ1總蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。結果表明，PNS可激活PI3K/Akt通路及PLCγ1通路。見圖4～6。

3 討論

SD的主要特征是進行性記憶和學習功能障礙。海馬是中樞神經系統中與學習記憶和情緒功能密切聯系的腦區，海馬神經元的損傷可導致認知功能障礙[9-13]。前期研究已經證實，PNS可以改善SAMP8小鼠的行為記憶能力[8]。然而PNS對SD神經元損傷的影響及其機制目前尚不清楚。本研究結果顯示，PNS可顯著減輕SAMP8小鼠神經元損傷，該作用可能與PI3K/Akt和PLCγ1/PKC信號通路有關。

尼氏小體是合成更新細胞器所必需的結構蛋白及合成神經遞質所必需的酶類，可作為神經元功能狀態的標志。當神經元受損時，尼氏小體數目減少、解體甚至消失[14-19]。因此尼氏染色是神經元特異染色實驗方法。由本實驗的尼氏染色結果顯示，對照組小鼠海馬CA1區錐體細胞排列整齊，尼氏小體數量多，染色均一，模型組海馬CA1區錐體細胞數量明顯減少，排列紊亂，有斷裂，尼氏染色不均一，而PNS給藥后，CA1區神經元細胞形態均有不同程度的恢復，尼氏小體數量增加，著色均一，這說明PNS可以減輕SAMP8小鼠海馬神經元的損傷。

AD是SD的主要類型。研究發現，PI3K/Akt信號轉導通路是參與細胞凋亡過程的經典信號通路，PI3K/Akt信號通路及其調節因子的異常表達與AD病人細胞凋亡有密切聯系[20-23]。研究報道Aβ可以通過抑制PI3K/Akt信號途徑而減輕神經元損傷，并改善動物學習記憶障礙[24]。PLCγ1被各種細胞因子激活水解產生肌醇3磷酸和甘油二酯兩種胞內產物，甘油二酯可激活PKC，從而發揮抗凋亡作用而促進細胞存活[25]。PLCγ1和PKC在AD患者腦內表達降低。因此，PLCγ1/PKC信號通路可能在AD細胞凋亡中發揮調控作用。為了探討PNS對PI3K/Akt和PLCγ1/PKC信號通路的影響，本研究主要從基因和蛋白水平上檢測了PI3K/Akt和PLCγ1/PKC相關基因和蛋白的表達水平。研究結果顯示，模型組SAMP8腦內PI3K、p-Akt、p-PLCγ1 蛋白表達明顯下降，而PNS均能不同程度的提高PI3K、Akt 、PLCγ1和PKC mRNA含量和上調PI3K、p-Akt 和p-PLCγ1蛋白表達。這提示PNS抑制神經元損傷可能與其激活PI3K/Akt和PLCγ1/PKC信號通路有關。

4 結論

PNS可以減輕SAMP8小鼠海馬神經元的損傷，這可能與其激活PI3K/Akt和PLCγ1/PKC信號通路有關。