節(jié)瓜基因組DNA提取方法比較研究

摘要：以節(jié)瓜的成熟干種子、子葉和不同發(fā)育階段的真葉為材料，選用尿素提取法、高鹽低pH值法、SDS法和CTAB法等4種DNA提取方法進(jìn)行比較。結(jié)果表明：不同節(jié)瓜材料均可以提取到基因組DNA，其中子葉和第1片真葉的提取效果最好；尿素提取法提取種子DNA最為簡便快捷，CTAB法提取葉片能得到純度較高的基因組DNA。經(jīng)PCR檢驗(yàn).干種子和子葉提取的基因組DNA都可用于PCR擴(kuò)增。

關(guān)鍵詞：節(jié)瓜；基因組DNA；提取方法；干種子；子葉

節(jié)瓜(BenincasahispidaCogn.vat.Chieh-quaHow.)又稱毛瓜、毛節(jié)瓜，是葫蘆科冬瓜屬作物，是冬瓜變種.主要以幼嫩果實(shí)為產(chǎn)品器官.是我國華南地區(qū)主要蔬菜作物之一.在東南亞地區(qū)也廣泛栽培。

DNA提取是生物技術(shù)研究的基礎(chǔ)步驟。隨著節(jié)瓜生物技術(shù)研究的開展，建立不同組織、不同器官基因組DNA的快速高效提取方法十分必要。在植物DNA提取方法研究中.前人多選用真葉作為試驗(yàn)材料.在節(jié)瓜上尚未見利用其他部分進(jìn)行DNA提取的報(bào)道.在DNA提取方法中常用的有CTAB法、SDS法等.由于瓜類作物中含有較多的糖類和多酚類物質(zhì).很容易干擾PCR擴(kuò)增效果，因此需針對(duì)具體的作物種類.探索高質(zhì)量DNA提取方法。謝大森等比較了冬瓜葉片DNA提取方法，認(rèn)為PVP法和CTAB-Free法提取冬瓜DNA質(zhì)量高.但數(shù)量偏少：程志學(xué)等㈣基于CATB法.建立了適合擴(kuò)增長度多態(tài)性(amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP)分子標(biāo)記技術(shù)的節(jié)瓜DNA提取方法。本研究在此基礎(chǔ)上.進(jìn)一步對(duì)不同組織以及不同DNA提取方法的效果進(jìn)行了比較.旨在建立節(jié)瓜基因組DNA的高效提取方法.為節(jié)瓜的相關(guān)分子生物學(xué)研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)材料為節(jié)瓜優(yōu)良自交系LTlR、A06一A111，由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所瓜類研究一室提供。取材部位分別為：(1)成熟的干種子；(2)展平的子葉；(3)第1片真葉；(4)成株(總節(jié)位30節(jié)左右，下同)上部幼嫩葉片(選取第25～29節(jié)位的葉片)；(5)成株中部葉片(選取第13-19節(jié)位的葉片)：(6)成株下部老葉(選取第3-9節(jié)位的葉片)。

1.2方法

本試驗(yàn)采取4種方法提取節(jié)瓜基因組DNA.分別是尿素提取法、高鹽低pH值法、SDS法和CTAB法。

1.2.1 尿素提取法參照李菊芬等的方法.具體操作步驟如下：(1)單粒去殼的干種子以及0.05g子葉或真葉分別置于預(yù)冷研缽中.干種子可直接加600μL提取液(7mol·L^-1尿素.0.2mol·^-1Tris-HCloH值8.0.0.05mol·L^-1EDTA.2％十二烷基肌氨酸鈉)迅速研磨并轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中：葉片需加入適量液氮迅速研磨成粉末狀.加入600μL提取液混勻并轉(zhuǎn)人1.5mL離心管中。(2)每管加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)劇烈振蕩.12000r·min^-1離心5min，取上清液(重復(fù)抽提1次)。(3)加入1／10體積NaAc(3mol·L^-1.pH值5.2)和等體積預(yù)冷異丙醇，輕輕混勻，12000r·inin^-1離心5min。(4)棄上清液。加入400IxLTE溶解沉淀。(5)加入1mL預(yù)冷無水乙醇.輕輕混勻，12000r·min^-1離心5min。(6)棄上清液，用預(yù)冷的75％乙醇洗滌沉淀1，2次.在超凈臺(tái)上吹干后加入適量ddH₂O將沉淀完全溶解。(7)加入5μLRNaseA(10g·L^-1)，37℃水浴40-60min.-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2高鹽低pH值法 參照王傳堂等、楊萍等的方法，部分改進(jìn)，具體操作步驟如下：(1)樣品處理方法同上述尿素提取法.加600IxL提取液.其組分為NaAc(0.1mol·L^-1)，EDTA(50mmol·L^-1)，NaCl(0.5mol·L^-1)，2％PVP，1.4％SDS，0.5％β-巰基乙醇.最后將提取液的pH值調(diào)至5.5；(2)65℃水浴40min：(3)加入2／3體積的3mol·L～KAc，冰浴30min(4)12000r·min^-1離心10min.取上清液，加入等體積預(yù)冷異丙醇，-20℃放置15min；(5)12000r·min^-1離心10min.棄上清液.沉淀用75％預(yù)冷乙醇洗滌(用無水乙醇洗滌利于吹干).放置于超凈臺(tái)上吹干：(6)加入500IxLTE溶解沉淀，沉淀完全溶解后加入5μL(10g·L^-1)，37℃水浴30min：(7)加入等體積氯仿，12000r·min。離心10min；(8)取上清液，加入等體積預(yù)冷異丙醇，-20℃靜置20min：(9)12000r·min^-1離心10min，棄上清液.預(yù)冷無水乙醇洗滌沉淀.在超凈臺(tái)上吹干后加入適量ddH₂O將沉淀完全溶解.-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3SDS法 參照李菊芬等、杜道林等的方法，具體操作步驟如下：(1)干種子和葉片的處理方法同前，加600μL提取液.其組分為100mm01.L^-1Tris-HClpH值8.0，100mmol·L^-1。EDTAoH值8.0，0.5mol·L^-1NaCl，1.5％SDS；(2)65CIC水浴30min，12000r·min^-1離心10min：(3)取上清液.加入等體積酚：氯仿：異戊醇(25：24：1).混勻后12000r·min^-1離心10min，重復(fù)抽提1次；(4)取上清液，加人等體積預(yù)冷的異丙醇輕輕混勻.5000r·min^-1離心10min；(5)棄上清液，用無水乙醇洗滌沉淀2～3次，置于超凈臺(tái)上吹干；(6)將其溶于適量ddH₂O中，加入5μLRNaseA(10g·L^-1).37℃水浴40min，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4CTAB法參考Porebski等的CTAB法并稍作改良，具體操作為：(1)用鑷子夾取0.05g左右的新鮮幼嫩葉片放人2mL離心管內(nèi)。加人液氮.用研杵棒迅速將葉片研磨成粉末.加入1000μL事先預(yù)熱的2％CTAB抽提緩沖液(1mol·L^-1Tris-HCloH值8.0，0.5mol·L^-1EDTApH值8.0.1.4mol·L^-1NaCl，2％CTAB，1％PVP，1％β-巰基乙醇)I單粒去殼的干種子置于預(yù)冷研缽中加入1000μL抽提液研磨成漿，混勻后轉(zhuǎn)入2mL的eppendorf管內(nèi).置于65℃水浴中溫浴40-50min(期間不時(shí)搖勻)。(2)靜置至室溫下，12000r·min^-1離心10min.取上清液轉(zhuǎn)移到新的2mL離心管內(nèi)。(3)加入等體積的酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)，劇烈振蕩20s，靜置5min，4℃，12000r·min^-1離心10min.取上清液轉(zhuǎn)移到新的1.5mL離心管，重復(fù)抽提1次。(4)加入2／3體積預(yù)冷的異丙醇，輕晃.置于-20℃冰箱30min或者過夜。(5)4℃，12000r.min^-1離心10min，棄上清液。用75％乙醇洗滌DNA(2～3次).放在超凈工作臺(tái)上吹干。(6)向1.5mL離心管中加入200mL滅菌TE將DNA溶解，再加入5μl(10g·L^-1)，37℃水浴60min。(7)加入等體積預(yù)冷的氯仿：異戊醇(24：1)混勻，靜置10min，4℃，12000r.min^-1離心10min。(8)取上清液，加入1／10體積的NaAc(3moL·L^-1，pH值5.4)，2倍體積的預(yù)冷無水乙醇。20℃放置30min或更長時(shí)間(過夜沉淀DNA量多但可能會(huì)有雜質(zhì)).4℃12000r·min^-1離心10min。(9)用無水乙醇洗滌DNA2次，在超凈工作臺(tái)上吹干。(10)加入適量的H₂O溶解DNA.-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1節(jié)瓜不同部位及不同生長時(shí)期材料對(duì)基因組DNA提取質(zhì)量的影晌

本試驗(yàn)采用CTAB法提取不同部位及不同生長時(shí)期的節(jié)瓜材料基因組DNA并進(jìn)行了比較，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，6種試驗(yàn)材料均能提取到基因組DNA(圖1)，其中干種子、子葉和成株節(jié)瓜中、下節(jié)位葉片DNA的電泳條帶較暗，第1片真葉和成株節(jié)瓜上部節(jié)位嫩葉DNA的電泳譜帶較亮，表明幼嫩葉片的DNA含量比較豐富。從測(cè)得的OD₂₆₀／OD₂₆₀(表1)看，干種子的比值為1.73，說明殘存有少量的蛋白質(zhì)：子葉和第1片真葉的比值最為理想，均在1.8-1.9：成株葉片的比值均在2.0以上，上部節(jié)位殘留的RNA也多。從干種子到成株的整個(gè)過程，基因組DNA提取的質(zhì)和量各不同，從干種子中提取的量最少.上部節(jié)位葉片的最多：從子葉和第1片真葉中提取的質(zhì)量最好。因此，綜合考慮，以節(jié)瓜子葉或第1片真葉為材料可獲得較為理想的基因組DNA。

2.2提取方法對(duì)節(jié)瓜種子與子葉基因組DNA提取質(zhì)量的影響

2.2.1節(jié)瓜干種子 用4種不同的方法提取節(jié)瓜A06-A111干種子的基因組DNA.經(jīng)1.2％瓊脂糖電泳檢測(cè)(圖2)顯示：用高鹽低pH值法提取的總DNA看不到條帶.說明提取量很少，用核酸蛋白儀檢測(cè)其濃度值也很低。其他3種方法OD₂₆₀／OD₂₆₀均在1.8左右.提取質(zhì)量較好.尿素提取法和SDS法帶型一致.條帶也較亮，CTAB法提取的量少。在4種方法當(dāng)中.尿素提取法所需時(shí)間最短，僅需要2h左右.步驟也相對(duì)簡單。因此，尿素提取法是一種快速、簡便適用于提取節(jié)瓜干種子基因組DNA的方法。

2.2.2節(jié)瓜子葉用4種不同的方法提取節(jié)瓜A06-A111子葉基因組DNA.經(jīng)1.2％瓊脂糖電泳檢測(cè)(圖3)顯示：用高鹽低pH值法提取的基因組DNA同樣看不到條帶，說明提取量很少。尿素提取法條帶稍有拖尾，測(cè)其OD₂₆₀/OD₂₆₀為1.73，說明有蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染。SDS法條帶亮度明顯高于其他3種方法.說明DNA濃度相當(dāng)大.但點(diǎn)樣孔附近殘留有蛋白等雜質(zhì)，而且稍有拖尾現(xiàn)象。CTAB法提取的基因組DNA濃度較小，但所含雜質(zhì)少、質(zhì)量高，其OD₂₆₀／OD₂₆₀為1.81。4種提取方法各有利弊，因此，在應(yīng)用當(dāng)中應(yīng)根據(jù)實(shí)際要求選擇最佳方法：如果對(duì)DNA純度要求不高.則SDS法和尿素提取法是較理想的方法：如果對(duì)DNA質(zhì)量要求較高.則CTAB法是最佳選擇.而且可以通過適當(dāng)加大提取樣品量解決提取基因組DNA量少的問題。

2.3PCR檢驗(yàn)不同方法所提取節(jié)瓜基因組DNA的適用性

對(duì)于4種不同方法提取的基因組DNA.用RAMP引物擴(kuò)增.檢驗(yàn)其是否適用于分子標(biāo)記。經(jīng)2％瓊脂糖電泳檢測(cè)(圖4)顯示：用4種方法提取的基因組DNA均可用于RAMP-PCR擴(kuò)增.且擴(kuò)增帶型一致.表明直接從干種子和子葉當(dāng)中提取的基因組DNA一樣，都可用于PCR擴(kuò)增。

3 討論

提取高質(zhì)量的基因組DNA是植物分子生物學(xué)研究的前提和基礎(chǔ)。建立利用不同部位、不同發(fā)育階段的試驗(yàn)材料提取基因組DNA的有效方法對(duì)于進(jìn)一步開展生物技術(shù)研究是非常必要的。目前有關(guān)節(jié)瓜、冬瓜DNA提取方法的報(bào)道均基于CTAB法.本研究比較了4種不同提取方法對(duì)DNA質(zhì)量的影響，為節(jié)瓜基因組DNA提取提供了更多可選擇的方法。不同的分子技術(shù)手段和不同研究目的對(duì)模板DNA的質(zhì)量要求也不盡相同。那些對(duì)模板DNA質(zhì)量要求不高的分子技術(shù)方法.尿素提取法無疑是最佳選擇。對(duì)AFLP等分子技術(shù)方法.模板DNA的制備是非常重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，模板DNA的質(zhì)量直接關(guān)系著試驗(yàn)的成敗。本試驗(yàn)中CTAB法提取的DNA純度較高，完全可以滿足AFLP等方法的反應(yīng)要求。因此針對(duì)不同的研究目的和分子技術(shù)手段.在實(shí)際應(yīng)用過程當(dāng)中要靈活選用不同的提取方法。

從不同部位不同器官不同發(fā)育階段的植物材料提取DNA對(duì)于拓寬植物材料取材范圍具有重要意義，特別是從干種子中提取基因組DNA不僅大大縮短了試驗(yàn)周期.也可節(jié)約試驗(yàn)成本.對(duì)于種子質(zhì)量檢測(cè)等試驗(yàn)操作非常必要。但種子中通常富含次生代謝產(chǎn)物，可能對(duì)DNA質(zhì)量產(chǎn)生干擾。Kesari等的試驗(yàn)結(jié)果表明，SDS法可以有效去除多糖、多酚及蛋白質(zhì)，從錫蘭、麻風(fēng)樹等木本油料作物干種子中提取高質(zhì)量基因組DNA。本研究結(jié)果也表明.SDS法用于節(jié)瓜干種子DNA的提取效果較好。同時(shí)發(fā)現(xiàn)尿素法也是提取節(jié)瓜干種子DNA簡便快捷的方法。用SDS法和尿素法提取的基因組DNA均可用來進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這一結(jié)果為簡便快捷提取節(jié)瓜基因組DNA提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

以節(jié)瓜的成熟干種子、子葉和不同發(fā)育階段的真葉為材料進(jìn)行基因組DNA提取.發(fā)現(xiàn)不同節(jié)瓜材料均可以提取到基因組DNA，其中子葉和第1片真葉的提取效果最好；對(duì)尿素提取法、高鹽低oH值法、SDS法和CTAB法等4種DNA提取方法進(jìn)行了比較，結(jié)果表明尿素提取法提取種子DNA最為簡便快捷，CTAB法提取葉片則可以得到純度較高的基因組DNA。經(jīng)PCR檢驗(yàn)，干種子和子葉提取的基因組DNA都可用于PCR擴(kuò)增。