西瓜雜交種子純度鑒定方法研究進(jìn)展

摘要：西瓜雜交種子純度鑒定一直是個(gè)技術(shù)難題，是雜交種子生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)的重要環(huán)節(jié)。文章綜述了利用傳統(tǒng)的田間種植鑒定西瓜雜交種子純度的方法，以及電泳技術(shù)和分子標(biāo)記技術(shù)等實(shí)驗(yàn)室技術(shù)手段在西瓜雜交種子純度快速鑒定應(yīng)用方面的研究進(jìn)展及存在的問題。

關(guān)鍵詞：西瓜；雜交種子；純度鑒定

西瓜是世界十大水果之一，我國(guó)西瓜栽培面積及產(chǎn)量均居世界首位，而優(yōu)質(zhì)的西瓜種子特別是雜交良種是各種類型西瓜栽培成功的前提。自20世紀(jì)80年代西瓜雜交一代品種在我國(guó)普及推廣以來，栽培面積迅速擴(kuò)大，但在人工制種過程中，由于隔離不嚴(yán)或人工去雄不及時(shí)、不徹底等原因而導(dǎo)致雜交一代種子不純，因而給生產(chǎn)造成了損失。所以，加強(qiáng)對(duì)西瓜雜交一代種子純度快速鑒定方法的研究，已成為西瓜良種生產(chǎn)中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。

當(dāng)前種子生產(chǎn)和經(jīng)營(yíng)部門對(duì)西瓜種子純度的檢測(cè)主要靠田間種植的方法。近年來，隨著生化及分子技術(shù)的發(fā)展以及在作物品種鑒定上的應(yīng)用，國(guó)內(nèi)外一些科研單位開展了利用蛋白質(zhì)電泳技術(shù)以及DNA分子標(biāo)記技術(shù)在西瓜雜交種子鑒定上的應(yīng)用研究，旨在探索一種準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、快速的實(shí)驗(yàn)室鑒定方法。

1 形態(tài)檢驗(yàn)法在西瓜種子檢測(cè)上的應(yīng)用

傳統(tǒng)的種子鑒定主要采用種子形態(tài)鑒定、苗期標(biāo)記形態(tài)鑒定、子房形態(tài)鑒定及果實(shí)形態(tài)鑒定等是目前西瓜品種純度鑒定的主要方法。

1.1種子形態(tài)鑒定法

除三倍體無籽西瓜外，一般雙親二倍體雜交一代西瓜種子形態(tài)與母本相同或相近，可根據(jù)母本種子的大小、色澤、形狀及種子表面裂紋、麻點(diǎn)的有無及多少判斷。三倍體無籽西瓜可從種子形態(tài)上進(jìn)行純度鑒定，其母本為四倍體，種子種胚發(fā)育好，種子飽滿，種面較凸：三倍體雜交種子種胚發(fā)育不好，種子較癟，種面平或凹入。該鑒定法在收種后可在室內(nèi)鑒定，鑒定周期最短，成本最低，一般只有三倍體無籽西瓜品種種子適于該法鑒定，但無法將母本相同父本不同的2個(gè)無籽西瓜品種區(qū)別開。

1.2苗期形態(tài)鑒定法

指從出苗至開花前的發(fā)育階段進(jìn)行形態(tài)鑒定。進(jìn)行苗期鑒定的品種，與母本相比必須有一些明顯的標(biāo)記性狀和特征。如葉形(全緣葉、缺裂葉等)，以全緣葉作母本、缺裂葉作父本的，表現(xiàn)缺裂葉的為雜交株，全緣葉的為假雜株，在幼苗3～4片葉時(shí)即能準(zhǔn)確識(shí)別，鑒定周期為30～40d，利用該性狀育成的西瓜品種有津豐1號(hào)等：葉片后綠性狀，后綠與一般正常綠幼苗或植株都有明顯的區(qū)別，苗期鑒定以子葉出土到幼苗長(zhǎng)出第1片葉最適宜，鑒別期為7～10d，應(yīng)用的西瓜品種有鄭果5506等。此外，該鑒定方法可利用的標(biāo)記性狀還有幼果皮色、蔓形(短蔓、緊湊等)、葉色(葉片黃斑等)、花蕾形狀、葉蔓光滑無毛、蔓無分枝等。但該鑒定法技術(shù)難度大，不易掌握。

1.3子房形態(tài)鑒定法

該法利用瓜胎或幼瓜等標(biāo)記性狀鑒定，從播種到瓜胎顯現(xiàn)為1個(gè)鑒定周期，需40-50d，是目前西瓜雜交種鑒定最常用的方法。不同類型子房的西瓜雜交組合其F₁代的子房形狀有區(qū)別，一般圓×長(zhǎng)的雜交組合如西農(nóng)8號(hào)類型，F(xiàn)₁代子房表現(xiàn)短橢圓形，圓子房為假雜株。長(zhǎng)×圓的組合如豐收2號(hào)類型，F(xiàn)₁代子房為短橢圓形、中部肥大，假雜株為長(zhǎng)橢圓形。圓×圓的組合如京欣1號(hào)類型，F(xiàn)₁代子房為高圓形，假雜株為圓形。該鑒定法優(yōu)點(diǎn)是鑒定周期較短，占地較少，鑒定成本較低：缺點(diǎn)是不能看出果形或皮色與雜交父本相似的其他自由交雜種植株，對(duì)鑒定地域的積溫條件要求較高。

1.4果實(shí)鑒定法

果實(shí)膨大后可從果面特征及剖面進(jìn)行鑒定。果面特征可從顏色深淺，外觀形狀，網(wǎng)紋或花皮，條帶的寬與窄、規(guī)則與鋸齒，有無果粉等特征進(jìn)行區(qū)分；果實(shí)成熟后剖瓤看籽，根據(jù)種子大小、形狀、顏色以及瓜瓤顏色鑒別其純度：無籽西瓜還可以看是否有種子以及空殼、秕籽的多少進(jìn)行鑒別。該法是西瓜品種特征最明顯、結(jié)果最可靠的鑒定方法，但周期長(zhǎng)，占地多，費(fèi)用大，對(duì)鑒定地域的積溫條件要求高。多用于仲裁鑒定、親本鑒定以及雜交種與雙親外觀差別不明顯的鑒定。

2 蛋白質(zhì)電泳技術(shù)在西瓜種子檢測(cè)上的應(yīng)用

蛋白質(zhì)電泳主要是利用聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)，通過分析作為基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)和同工酶來鑒定品種純度。該法包括同工酶電泳法和種子貯藏蛋白質(zhì)電泳法，2種方法在西瓜種子純度鑒定上都有報(bào)道。

2.1同工酶電泳法鑒定

黃永紅等㈣對(duì)6個(gè)西瓜雜交組合進(jìn)行了過氧化物同工酶純度鑒定研究。結(jié)果表明，利用苗期過氧化物同工酶可以進(jìn)行西瓜雜交種真實(shí)性與純度鑒定。陳清華等對(duì)無籽西瓜組合G₁、雜交西瓜組合G₂及其雙親不同生長(zhǎng)期、不同部位的過氧化物酶、酯酶同工酶進(jìn)行研究的結(jié)果表明，G₁母本胚根、第1真葉的過氧化物酶同工酶，胚芽、子葉及第2、第3真葉的酯酶同工酶酶譜明顯異于子代：G₂母本的胚芽、子葉及第2真葉的酯酶同工酶酶譜明顯異于子代。馬國(guó)斌㈣對(duì)西瓜雜交種西農(nóng)8號(hào)和無籽西瓜黑蜜2號(hào)及其父母本苗期子葉的3種同工酶進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，過氧化物酶同工酶多態(tài)性較高，且該同工酶活性高，活性不易喪失，染色也較簡(jiǎn)單，在西瓜雜交種純度鑒定中具有很好的適用性。

但有關(guān)西瓜雜種純度鑒定電泳技術(shù)的報(bào)道各研究結(jié)果出入很大。鄭秋素等發(fā)現(xiàn)，在酯酶、過氧化物酶與多酚氧化酶的同工酶檢驗(yàn)中，西瓜雜交組合與雙親間的酶帶僅存在深淺上的差異。張興平等㈣對(duì)西瓜的10個(gè)雜種及其16個(gè)親本的過氧化物酶同工酶和酯酶同工酶進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，西瓜雜種與其親本在同工酶表現(xiàn)上的關(guān)系很復(fù)雜，若受檢的西瓜品種間沒有足夠大的遺傳差異，則其種子的過氧化物酶、酯酶的差異很小或無差異。柳李旺等研究認(rèn)為，西瓜是遺傳變異度較小的作物，位點(diǎn)多態(tài)性較低，同工酶蛋白質(zhì)電泳難以用于F₁代雜種純度檢測(cè)與品種鑒定。曹宛紅等的研究結(jié)果表明，過氧化物酶同工酶僅在某些西瓜品種間表現(xiàn)出差異，而對(duì)于像京欣1號(hào)這種父母本親緣關(guān)系很近的雜交種，4種同工酶系統(tǒng)及可溶性蛋白檢驗(yàn)技術(shù)均不可能有效地進(jìn)行純度鑒定。朱立武等研究了西瓜4個(gè)雜交組合種子及其萌芽期過氧化物酶同工酶譜特征。結(jié)果表明，4個(gè)雜交一代種子萌芽期幼苗過氧化物酶同工酶譜表現(xiàn)為無差別、母本型等，無法鑒定雜種。

2.2種子蛋白質(zhì)電泳法鑒定

黃為平等㈣研究表明，利用種子水溶蛋白等電聚焦丙烯酰胺電泳的方法，可以鑒定京欣l號(hào)，京抗2號(hào)、3號(hào)雜交種子純度。王璽等㈣利用種子蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳等多種電泳技術(shù)對(duì)西瓜雜交種進(jìn)行了純度鑒定，結(jié)果表明干種子蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳法在一定條件下，可將供試西瓜雜交種與其親本種子明顯區(qū)分開。李麗等對(duì)京欣1號(hào)、金花寶2個(gè)雜交種的研究顯示，在種子蛋白質(zhì)SDS—PAGE電泳圖譜中找到一代雜種與父母本的鑒別帶能進(jìn)行雜交種純度鑒定。王景升等研究表明，4種同工酶譜帶的穩(wěn)定性和品種間的特異性均以酯酶同工酶最強(qiáng)，適于用做品種鑒定，但都無法將供試的13份試材區(qū)分開，只有蛋白質(zhì)電泳譜帶可以將其區(qū)分開。萬云龍等分析了西瓜雜交種蘇蜜5號(hào)、早抗京欣和抗病蘇蜜及其父母本種子的酯酶、過氧化物酶、多酚氧化酶及種子蛋白。結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)和同工酶難以發(fā)現(xiàn)統(tǒng)一的譜帶特征來檢測(cè)不同西瓜雜交種子的純度。

3 分子標(biāo)記技術(shù)在西瓜種子檢測(cè)中的應(yīng)用

分子標(biāo)記技術(shù)是通過直接分析遺傳物質(zhì)(DNA)的多態(tài)性來比較基因組的結(jié)構(gòu)與組成，通過鑒定DNA水平上的差異來鑒別品種。目前，在西瓜種子純度鑒定中主要應(yīng)用的DNA分子標(biāo)記技術(shù)有擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplifiedfragmentlengthpolvmorphism，AFLP)技術(shù)、隨即擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(ran—domamplifiedpolymorDhicDNA，RAPD)技術(shù)、簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simplesequencerepeats，SSR)技術(shù)和相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-relatedamplifedpolymor—ohism，SRAP)技術(shù)等。

車克鵬等利用高效可靠的AFLP技術(shù)對(duì)逾30個(gè)西瓜材料進(jìn)行研究并建立了DNA指紋圖譜，利用圖譜可以有效地區(qū)分不同西瓜材料。劉文革等對(duì)西瓜二倍體及同源多倍體的遺傳差異進(jìn)行AFLP分析，結(jié)果表明大部分引物組合擴(kuò)增出的不同倍性西瓜之間的AFLP譜帶無明顯差異，表明不同倍性西瓜間的多態(tài)性很低。前人對(duì)西瓜進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果表明西瓜品種間同源性較高，遺傳基礎(chǔ)狹窄，多數(shù)品種親緣關(guān)系較近。

歐陽(yáng)新星等對(duì)京欣1號(hào)及其父母本篩選了320個(gè)RAPD引物，得到1個(gè)引物可以區(qū)分母本和雜交種，但不能區(qū)分父本和雜交種，同時(shí)對(duì)42份國(guó)內(nèi)外西瓜種質(zhì)材料進(jìn)行了RAPD分析，從600個(gè)隨機(jī)引物中篩選10多個(gè)重復(fù)性好、能產(chǎn)生多態(tài)性的引物，找到了某些特殊的RAPD譜帶，但效果不太明顯。王鳴剛等以不同西瓜雜交種及親本自交系為材料，研究利用RAPD技術(shù)鑒定西瓜雜種的純度及種質(zhì)的方法。結(jié)果表明，在反應(yīng)條件適合、引物選擇正確的情況下，RAPD技術(shù)完全適合于西瓜雜交種純度的早期鑒定，閆鵬等選用100條隨機(jī)引物對(duì)西瓜甜瓜雜種一代和其父母本的種子進(jìn)行RAPD分析。結(jié)果表明，在100條引物中篩選出了4條有特征條帶的引物能進(jìn)行西瓜雜交種的純度鑒定。日本的Hashizume等用RAPD技術(shù)成功鑒定了西瓜雜交種Fiiihikari的純度。

艾呈祥等以2個(gè)西瓜雜交品種(系)的種子及其親本為材料用SSR標(biāo)記鑒別真假雜種，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)SSR引物對(duì)自交系的擴(kuò)增只出現(xiàn)1條條帶，但部分引物在某些自交系中擴(kuò)增出2條條帶，所測(cè)純度與田間純度非常接近，表明SSR標(biāo)記可應(yīng)用于西瓜雜交種子純度鑒定。田雷等以4個(gè)西瓜雜交種和8個(gè)親本為試驗(yàn)材料，篩選出了能夠區(qū)分4個(gè)雜交種與雙親，并具有互補(bǔ)帶型的SSR引物，建立了適于SSR分子標(biāo)記檢測(cè)西瓜種子品種純度的反應(yīng)體系。試驗(yàn)結(jié)果證明，這套檢測(cè)技術(shù)體系可用于西瓜雜交種品種純度室內(nèi)快速鑒定。

劉澤發(fā)等采用SRAP技術(shù)，成功篩選出1對(duì)多態(tài)性好的引物對(duì)E2M5，對(duì)二倍體小果型西瓜品種紅小玉雜交種純度開展了分子鑒定研究。試驗(yàn)結(jié)果表明，E2M5引物對(duì)在紅小玉雜交種和親本間擴(kuò)增出品種特異性條帶，適合在室內(nèi)快速準(zhǔn)確地進(jìn)行雜交種的純度鑒定，試驗(yàn)結(jié)果與大田鑒定結(jié)果吻合率高。

4 研究展望

形態(tài)學(xué)種植觀察、蛋白質(zhì)電泳分析和DNA分子標(biāo)記等不同方法均可實(shí)現(xiàn)對(duì)西瓜雜交種子純度的鑒定。形態(tài)學(xué)鑒定具有直觀、技術(shù)容易掌握等優(yōu)點(diǎn)，但易受環(huán)境影響，結(jié)果不夠準(zhǔn)確，田間種植鑒定周期太長(zhǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且不利于種子及時(shí)銷售。利用同工酶和蛋白質(zhì)電泳圖譜鑒定具有靈敏度高、準(zhǔn)確、易操作等優(yōu)點(diǎn)，但同工酶位點(diǎn)及蛋白質(zhì)種類有限，對(duì)親緣關(guān)系很近的雜交種難以區(qū)分，且沒有一種大家公認(rèn)可靠的西瓜種子蛋白質(zhì)或同工酶的電泳譜帶可用來進(jìn)行西瓜品種的純度鑒定。RAPD技術(shù)與其他分子標(biāo)記方法比較具有簡(jiǎn)單、快速的優(yōu)點(diǎn)，尤其是在鑒定大量個(gè)體的雜種或品種純度方面具有優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行雜交種純度的鑒定已有許多報(bào)道，只要能通過技術(shù)上的改進(jìn)提高試驗(yàn)的重復(fù)性，就能使該技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)；SSR技術(shù)，以PCR為基礎(chǔ)，具有信息含量高，呈共顯性遺傳，易于分析，重復(fù)性、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，非常適合用于雜交種品種純度的鑒定。SRAP標(biāo)記特異性和可重復(fù)性較高，利用該技術(shù)進(jìn)行種子純度鑒定具有方法簡(jiǎn)單、可靠的特點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于西、甜瓜種子純度鑒定。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，直接在DNA水平上進(jìn)行基因組差異分析的技術(shù)，愈來愈多地被用于作物品種鑒定的研究。因此，加強(qiáng)分子標(biāo)記在鑒定西瓜種子純度上的應(yīng)用研究，為西瓜種子質(zhì)量的檢測(cè)提供準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、快速的室內(nèi)種子純度鑒定體系十分必要。今后應(yīng)加強(qiáng)開發(fā)以PCR技術(shù)為核心的SSR、SRAP、SCAR等分子標(biāo)記引物，充分利用不同分子標(biāo)記技術(shù)以加快遺傳圖譜的整合工作，完善高密度遺傳標(biāo)記連鎖圖譜：同時(shí)在遺傳圖譜構(gòu)建方面，積極開展SNP標(biāo)記、EST標(biāo)記等新型分子標(biāo)記在西瓜上的研究應(yīng)用。