運動性免疫抑制中胸腺IL-7和TGF-β1應答性特征

張琳，郝選明

（華南師范大學，廣東 廣州 510006）

運動性免疫抑制中胸腺IL-7和TGF-β1應答性特征

張琳，郝選明

（華南師范大學，廣東 廣州 510006）

通過胸腺細胞因子IL-7和TGF-β1及其mRNA進行研究，探討運動性免疫抑制發生發展過程中胸腺細胞發育的調節機制。將128只8周齡雄性SD大鼠隨機分為運動組和對照組，運動組進行遞增負荷跑臺訓練6周，每周6次，周日休息，每次30 min。第1周負荷為10 m·min-1，第2周負荷為20 m·min-1，此后每周增加5 m·min-1，至6周時達40 m·min-1。分別于第0、2、4、6周利用ELISA和FQ-RT-PCR技術測相對安靜狀態、運動后即刻和運動后3 h IL-7和TGF-β1及其mRNA的表達水平。結果顯示：6周遞增負荷跑臺運動過程中，IL-7和TGF-β1呈現幾乎相反的應答性變化：IL-7及mRNA第0周、第2周末運動后明顯降低，恢復3 h后升高，呈“V”型應答曲線；第4周末，運動前后沒有顯著性變化；第6周末，在運動后持續下降。TGF-β1在各周呈現倒“V”型變化，TGF-β1 mRNA對負荷初次應答時運動前后沒有明顯變化，其它各周呈倒“V”型變化。以上結果說明運動性免疫抑制發生發展中胸腺IL-7下降和TGF-β1升高可能導致胸腺微環境紊亂，從而影響胸腺細胞發育。

運動生物化學；運動性免疫抑制；白介素-7；轉化生長因子-β；胸腺；應答性特征

T細胞在胸腺內的發育分化是細胞免疫應答所必需的重要過程。胸腺細胞分化是一個受嚴格調控的過程，不僅依賴于早期T細胞前體與基質細胞的相互作用，而且細胞間的相互作用以及細胞因子在胸腺細胞分化過程中也發揮關鍵作用。白介素-7(interleukin-7，IL-7)和轉化生長因子-β1 (transforming growth factor beta 1，TGF-β1)是具有生長因子樣作用的細胞因子，具有調控多種免疫應答的作用[1-2]。IL-7促進早期胸腺細胞的分化和增殖，在胸腺細胞發育中起正性調節作用[3]。TGF-β超家族對T細胞的發育具有負調控作用，抑制早期胸腺細胞的增殖分化[4]。因此，本研究通過觀察SD大鼠6周遞增運動負荷后，胸腺組織中的生長因子IL-7、TGF-β1的應答性變化，探討長期運動對胸腺細胞發育調節機制，為運動性免疫抑制的調控提供依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8周齡雄性SD大鼠128只(購自廣東中醫藥大學實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2008-0020；NO:0043379，粵監證字F2008A002)，隨機分為實驗組和對照組。實驗組96只進行6周遞增強度訓練，對照組32只，正常喂養，不進行運動干預，分別于第0、2、4、6周末采樣，用于判別大鼠生長對測試指標的影響。結果發現，對照組各指標各周之間沒有顯著性差異(P>0.05)，表明6周生長對這些指標沒有顯著影響。

1.2 運動模型

采用我們通過反復實驗性探索獲得的運動性免疫抑制的動物模型[5-7]。運動性免疫抑制的建立條件是：模擬運動訓練安排，長時間、大強度且負荷遞增。因此，采用低強度適應性運動(10 m/min)訓練1周后，負荷遞增至20 m/min。隨后，每周遞增負荷增量5 m/min。至第6周，達到40 m/min，基本達到大鼠最大負荷強度。分別在第0、2、4、6周最后一次運動后48 h采樣。采樣日進行與上周相同負荷的跑臺運動，分別在安靜狀態(A)、運動后即刻(J)和運動后3 h(3 h)無菌取胸腺。

1.3 測試指標及方法

ELISA和實時熒光定量RT-PCR分別測定生長因子IL-7、TGF-β1及mRNA表達水平。ELISA試劑購自武漢華美公司，RNAiso Plus 和SYBR Green I Real time PCR反應試劑購自(TaKaRa)大連寶生物公司。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，序列如下：

1.4 數據的統計學處理

2 結果與分析

2.1 各周運動負荷及恢復過程中IL-7及mRNA的變化

圖1顯示，第0周J組大鼠胸腺組織IL-7及mRNA表達與A組相比下降(P<0.05)，運動后3 h組恢復，與A組比較，無顯著性意義(P>0.05)。J組和3 h組在第2、4和6周IL-7質量分數和IL-7 mRNA表達均低于A組(P<0.05或P<0.01)。在第2、4周J組與A組比較均顯著性下降(P<0.01)，3 h組與J組比較上升，但低于A組(P<0.01)。在第6周J組低于A組，且3 h組與J組相比差異無顯著性(P>0.05)。

圖1 胸腺IL-7及mRNA各周應答性變化情況

2.2 各周運動負荷及恢復過程中TGF-β1及mRNA的變化

圖2顯示，第0周J組大鼠胸腺組織TGF-β1表達水平與A組相比上升(P<0.01)，運動后3 h組略高于對照組。第 0周各組 mRNA表達無顯著性變化(P>0.05)。J組、3 h組在第2、4和6周TGF-β1質量分數均高于A組(P<0.05或P<0.01)。在第2周和第4周J組與A組比較均顯著性上升(P<0.01)，3 h組與J組比較下降(P<0.01)，但均高于A組(P<0.01)。在第6周J組、3 h組均高于A組，其中TGF-β1質量分數差異無顯著性(P>0.05)，TGF-β1mRNA差異顯著(P<0.01)，J組、3 h組兩組間差異有非常顯著性(P<0.01)。

圖2 胸腺TGF-β1及mRNA各周應答性變化情況

3 討論

3.1 運動性免疫抑制發展中胸腺IL-7的應答及調控機制

為探討運動性免疫過程中胸腺細胞的調控機制，我們研究了遞增負荷運動過程中胸腺組織 IL-7及其mRNA的表達變化。從實驗結果來看，IL-7及 mRNA在胸腺組織中表達，且表達量隨運動負荷的增加和時間的延長出現應答性的波動：IL-7及mRNA第0、2周末運動后明顯降低，恢復3 h后升高，呈“V”型應答曲線；第4周末，運動前后沒有顯著性變化；第6周末，則在運動后持續下降。總之，IL-7在第4周時雖然沒有繼續下降，但表現出隨著運動負荷的增加而逐漸下降，出現下調趨勢。

IL-7表達下調影響了IL-7對細胞生長信號需求的應答能力，而使機體無法充分利用IL-7的生長調控信號，進而導致進行性胸腺細胞發育異常以及隨后的成熟淋巴細胞的失調控。其可能的機制是：首先，IL-7是胸腺雙陰性(double-negative，DN)祖細胞發育的重要信號，IL-7的下調直接影響 DN及下游雙陽性(double-positive，DP)、單陽性(single-positive，SP)細胞的發育。其次，運動狀態下，神經、內分泌以及內環境的改變都會對免疫系統產生不同影響，免疫抑制類調節物質如促腎上腺皮質激素釋放激素、促腎上腺皮質激素、糖皮質激素等在運動刺激作用下明顯增加，再加上交感神經興奮所產生的免疫抑制效應，對免疫系統會產生強烈的抑制作用。研究表明，IL-7通過影響細胞內的生長因子水平，保護T細胞免受糖皮質激素、細胞因子下降以及輻射等誘導的細胞損傷[8]。第三，Fas介導的細胞凋亡在運動免疫抑制發展中起了重要的作用，而其中IL-7可能與這一凋亡機制有關。IL-7通過上調Bcl-2的信號傳導能夠加強發育中的胸腺細胞和成熟T細胞的存活[9]。因此，IL-7水平的下降，Fas等對胸腺細胞的致凋亡作用的保護能力下降是導致在運動性免疫抑制過程中T淋巴細胞發育分化異常的機制之一。

3.2 運動性免疫抑制發展中胸腺 TGF-β1應答及調控機制

TGF‐β在胸腺細胞本身和胸腺上皮細胞中都有表達，主要是作為一個免疫抑制因子，負性調節T細胞的發育。最初觀察TGF-β1影響T細胞成熟的特異信號的是Plum J等[10]，他報道外源性的TGF-β1劑量依賴性地抑制FTOC胸腺細胞的生長，胸腺細胞總數下降95%以上，DN、DP和CD4+SP胸腺細胞的分化也受影響，但CD8+SP不受影響。進一步對DN細胞亞群的研究表明，外源性加入 TGF-β1時 DN1亞群為81%，而未經處理時為30%，表明TGF-β1抑制DN亞群的增殖主要在DN1階段。Takahama Y等[11]報道，TGF-β1阻止DN細胞的增殖，控制CD4 CD8low-DP細胞的轉變，但誘導DN細胞表達CD8。Mossalayi MD等[12]研究表明，TGF-β1在 TN細胞表達，激活后抑制 TN的增殖，通過自分泌途徑負性調節胸腺細胞成熟。也有證據表明 TGF-β影響人類胸腺上皮細胞(thymic epithelial cells，TECs)：TGF-β1 調控 TECs細胞因子表達影響T細胞發育[13]。Christ M等[14]對TGF-β1缺失小鼠的研究中，觀察到胸腺細胞CD4+SP增加。Boivin GP等[15]的TGF-β1缺失小鼠研究也表明，胸腺細胞中DP亞群減少，DN和CD4+SP T細胞增加，提示，TGF-β1可能促進DP細胞向CD8+SP分化，和/或抑制CD4+SP分化。

為了研究 TGF-β1在運動性免疫抑制發生發展過程中對胸腺T細胞發育的作用，我們分析了TGF-β1在遞增負荷跑臺訓練 SD大鼠胸腺中的水平及mRNA表達的動態變化。結果顯示，TGF-β1在各周運動后明顯升高，恢復3 h下降，呈現倒∨型變化，TGF-β1 mRNA對負荷初次應答時運動前后沒有明顯變化，其它各周呈倒∨型變化。這表明運動應激誘導了TGF-β1在胸腺細胞中的變化，而且隨著運動負荷的增加TGF-β1水平逐漸升高，出現上調趨勢。

TGF-β1水平上升直接可能抑制胸腺細胞的發育成熟，導致胸腺細胞發育分化異常。因此可導致機體免疫功能紊亂，引起運動性免疫抑制。其可能的機制為：TGF-β1與調節DN1到DN2的過渡有關，促進DP細胞向 CD8+定型，抑制 CD4+分化。因此，TGF-β1的上調可能直接抑制了DN細胞的擴增，DP細胞的分化，引起 DN、CD8+細胞的積聚和(或)CD8+代償性擴增，同時CD4+細胞增殖數量下降。另外，Suda T等[16]報道，TGF-β1抑制 IL-7依賴的胸腺細胞的增殖作用。提示本研究中，IL-7下調以及TGF-β1的上調可能與胸腺細胞的分化發育異常相關聯，共同調控了免疫抑制的發生發展。但它們的信號通路彼此間的相互作用以及在T細胞發育中的詳盡歷程等都需要進一步研究證實。

[1]Schlenner S M，Madan V，Busch K，et al. Fate mapping reveals separate origins of T cells and myeloid lineages in the thymus[J]. Immunity，2010，32(3)：426-436.

[2]Diener K R，Need E F，Buchanan G，et al. TGF-beta signalling and immunity in prostate tumourigenesis[J].Expert Opin Ther Targets，2010，14(2)：179-192.

[3]張琳，郝選明，鄧樹勛，等. IL-7/IL-7在T淋巴細胞發育中的作用及對運動免疫的意義[J]. 國際免疫學雜志，2010，33(5)：447-450.

[4]張琳，郝選明. TGF-β對T細胞發育分化的影響與運動性免疫抑制[J]. 中國運動醫學雜志，2011，30(1)：104-108.

[5]唐亮. 大鼠細胞免疫功能對六周遞增負荷運動的應答性和適應性特征[D]. 廣州：華南師范大學，2007.

[6]王雪芹. T細胞活性與巨噬細胞吞噬能力對長期遞增負荷運動的應答和適應特征[D]. 廣州：華南師范大學，2005.

[7]李杰. 大鼠脾淋巴細胞分泌IL-2和sIL-2R對長期遞增負荷運動的應答和適應特征[D]. 廣州：華南師范大學，2007.

[8]Hernández-Caselles T，Martínez-Esparza M，Sancho D，et al. Interleukin-7 rescues human activated T lymphocytes from apoptosis induced by glucocorticoesteroids and regulates bcl-2 and CD25 expression[J]. Hum Immunol，1995，43(3)：181-189.

[9]Carini C，McLane M F，Mayer K H，et al. Dysregulation of interleukin-7 receptor may generate loss of cytotoxic T cell response in human immunodeficiency virus type 1 infection[J]. Eur J Immunol，1994，24(12)：2927-2934.

[10]Plum J，De Smedt M，Leclercq G，et al. Influence of TGF-beta on murine thymocyte development in fetal thymus organ culture[J]. J Immunol，1995，154(11)：5789-5798.

[11]Takahama Y，Letterio J J，Suzuki H，et al. Early progression of thymocytes along the CD4/CD8 developmental pathway is regulated by a subset of thymic epithelial cells expressing transforming growth factor beta[J]. J Exp Med，1994，179(5)：1495-1506.

[12]Mossalayi M D，Mentz F，Ouaaz F，et al. Early human thymocyte proliferation is regulated by an externally controlled autocrine transforming growth factor-beta 1 mechanism[J]. Blood，1995，85(12)：3594-3601.

[13]Schluns K S，Cook J E，Le P T. TGF-beta differentially modulates epidermal growth f actor-mediated increases in leukemia-inhibitory factor，IL-6，IL-1 alpha，and IL-1 beta in human thymic epithelial cells[J]. J Immunol，1997，158(6)：2704-2712.

[14]Christ M，McCartney-Francis N L，Kulkarni A B，et al. Immune dysregulation in TGF-beta 1-deficient mice[J]. J Immunol，1994，153(5)：1936-1946.

[15]Boivin G P，O'Toole B A，Orsmby I E，et al. Onset and progression of pathological lesions in transforming growth factor-beta 1-deficient mice[J]. Am J Pathol，1995，146(1)：276-288.

[16]Chantry D，Turner M，Feldmann M. et al. Interleukin 7 (murine pre-B cell growth factor/lymphopoietin 1) stimulates thymocyte growth: regulation by transforming growth factor beta[J]. Eur J Immunol，1989，19(4)：783-786.

Responsive Characteristics of IL-7 and TGF-β1 in thymus during Exercise-induced Immunosuppression

ZHANG Lin，HAO Xuan-ming
（South China Normal University，Guangzhou 510006，China）

To investigate the regulatory mechanism of thymocyte development during exercise-induced immunosuppression, IL-7 and TGF-β1 as well as their mRNA of rats in thymus were tested. A total of 128 Sprague–Dawle male rats, aged 8 weeks, were divided into Control Group and Exercise Group. Incremental ergomitry Exercise protocol (10 m·min-1in week1, 20 min week2, 5 m·min-1increased per week, successive 6 weeks, 6 d per week, 30 min per day). Samples were taken in week 0, week 2, week 4 and week 6 before exercise, just after exercise and 3 h after exercise, respectively. IL-7 and TGF-β1 as well as their mRNA of rats in thymus were calculated by ELISA and FQ-RT-PCR. Results:1) During six weeks incremental exercise: The responsive tendency of IL-7 and its mRNA presented the shape of “V” letter during week 0 and week2，while there was no distinguished changes during week4,and last decreased in week6. TGF-β1 and its mRNA presented that of inversed “V” letter during every week, except its mRNA was no prominent change in week0. Conclusion: The decrease of IL-7 and increase of TGF-β1 during Exercise-induced immunosuppression could be resulted the disorder of thymic microenvironment which effected thymocyte development.

exercise biochemistry；exercise-induced immunosuppression；interleukin-7(IL-7)；transforming growth factor beta 1(TGF-β1)；thymus；responsive characteristics

張琳(1971-)，女，在站博士后，研究方向：運動免疫學。通訊作者：郝選明教授。

G804.7

A

1006-7116(2011)04-0137-04

2010-12-05

廣東省自然科學基金(9151063101000059)；第49批中國博士后科學基金面上資助項目(20110490909)。

·民族傳統體育·