兩種銅(Ⅱ)-司帕沙星配合物與DNA作用及生物毒性比較*

付懷洲,劉向偉,張前前**,李 苓,張棟梅,牛淑妍

(1.中國海洋大學化學化工學院,山東青島266100;2.青島科技大學化學與分子工程學院,山東青島266042)

兩種銅(Ⅱ)-司帕沙星配合物與DNA作用及生物毒性比較*

付懷洲1,劉向偉1,張前前1**,李 苓1,張棟梅1,牛淑妍2

(1.中國海洋大學化學化工學院,山東青島266100;2.青島科技大學化學與分子工程學院,山東青島266042)

選擇銅(Ⅱ)-司帕沙星-鄰菲啰啉Cu(sf)phenCl(sf代表司帕沙星負離子,phen代表鄰菲啰啉)和銅(Ⅱ)-司帕沙星Cu(sf)22種配合物,通過電子吸收光譜法、熒光分析法及瓊脂糖凝膠電泳法研究了其與DNA的作用,首次以斑馬魚胚胎為模式生物,研究了它們的生物毒性,并對2種配合物的研究結果進行了比較。光譜實驗結果表明:Cu(sf)phenCl與DNA的作用強于Cu(sf)2;瓊脂糖凝膠電泳實驗結果顯示:在抗壞血酸存在條件下,Cu(sf)phenCl對pBR322質粒DNA的切割作用更強;同時,斑馬魚胚胎毒性實驗顯示Cu(sf)phenCl對斑馬魚胚胎毒性也更大。

銅(Ⅱ)-司帕沙星配合物;DNA作用;瓊脂糖凝膠電泳;斑馬魚胚胎;生物毒性

喹諾酮類藥物是一類合成抗菌藥,和其他抗菌藥的作用點不同,它們以細菌的脫氧核糖核酸(DNA)為靶,能有效抑制細菌DNA的復制。近年來,喹諾酮類藥物的銅配合物研究相當活躍,如銅(Ⅱ)與西諾沙星、環丙沙星、氧氟沙星等形成的配合物,以及銅與喹諾酮、鄰菲啰啉的混配配合物均有報道[1-6]。司帕沙星(Hsf)屬于第三代喹諾酮類藥物,具有抗菌譜廣、抗菌活性強等優點,Efthimiadou等[7-8]發現司帕沙星的銅配合物Cu(sf)(phen)Cl和Cu(sf)2比司帕沙星具有更好的抗菌活性,且Cu(sf)(phen)Cl能與DNA發生插入作用,具有更強的降低人類白血病細胞HL-60增殖的能力。斑馬魚是理想的毒性評價模型[9-11],斑馬魚基因與人類基因的相似度達到87%,而且作為體內生物活性研究的模式動物,具有試驗周期短的優點。另外,斑馬魚胚胎對藥物十分敏感,實驗毒性指標敏感度均高于成魚急性毒性實驗。本文對Cu(sf)(phen)Cl和Cu(sf)2與DNA作用的電子吸收光譜和熒光光譜進行比較研究,同時研究了其對pBR322質粒DNA的切割作用,并首次嘗試將斑馬魚胚胎作為生物模型應用于金屬配合物的生物毒性研究,旨在為高效低毒藥物研發提供理論依據。

1 實驗部分

1.1 儀器試劑與材料

島津UV-2550型紫外-可見分光光度計;日立F-4600型熒光光譜儀;北京六一DDY-8C型電泳儀及WD-9413B凝膠成像分析儀。

鮭魚精DNA(生化試劑,sigma公司),其純度用UV譜檢測,A260/A280>1.8,濃度用260 nm處的摩爾消光值檢測(ε=6 600 mol-1·cm-1);溴化乙錠EB(生化試劑,美國Am resco公司);pBR322質粒DNA(生化試劑,廣州東盛生物科技有限公司);瓊脂糖(生化試劑,西班牙原裝,基因科技有限公司分裝);6×loading buffer(生化試劑,sigma公司);Gold View(生化試劑,sigma公司);抗壞血酸(分析純,sigma公司);司帕沙星(分析純,北京萊瑞森醫藥科技有限公司);三(羥甲基)氨基甲烷以及其它試劑均為國產分析純。

Tris-NaCl緩沖液(p H=7.40,p H=7.60);SBA電泳液(45 mmol·L-1硼酸,1 mmo l·L-1氫氧化鈉,p H=8.45);分析實驗用水為二次水。

2種配合物(配合物1為Cu(sf)phenCl,配合物2為Cu(sf)2)按照文獻[7-8]合成,通過紅外光譜、元素分析、差熱-熱重分析對配合物進行表征,結果與文獻一致。

斑馬魚購于青島南山花卉市場,飼養斑馬魚的水是充氧飽和、溫度保持恒定(25±1)℃的自來水。

1.2 配合物對DNA作用的紫外光譜

在p H=7.40的Tris-NaCl緩沖液中加入8.86×10-3mol·L-1DNA及不同濃度的配合物溶液,以相應濃度的配合物溶液為參比,測量其紫外吸收光譜,波長范圍為190～360 nm。根據文獻[12]計算減色率:H=(A0-Ab)/A0,其中A0和Ab分別為未加配合物和加入配合物的DNA溶液的吸光度。類似地,用相應的方法進行DNA對銅-司帕沙星配合物紫外光譜的影響的實驗。

1.3 配合物對EB-DNA體系作用的熒光光譜

在p H=7.40的Tris-NaCl緩沖液中分別加入一系列不同濃度的配合物、1.7×10-5mol·L-1DNA和1×10-5mol·L-1EB,測量該體系在550～660 nm范圍內的發射熒光光譜,激發波長為525 nm,激發發射狹縫寬均為5 nm,發射光譜掃描速度15 nm·s-1。

1.4 瓊脂糖凝膠電泳

將125 ng質粒pBR322 DNA與不同濃度的配合物以及50倍于配合物濃度的還原劑抗壞血酸混合,然后用p H=7.60的Tris-NaCl緩沖液定容至5μL,反應溫度37℃,待反應時間分別為10和40 min時,用2～3μL的6×loading buffer終止反應。在0.8%瓊脂糖凝膠和SBA電泳液(p H=8.45)中電泳一定時間(電壓為220 V),以2～3μL的Gold View作為凝膠著色劑,用凝膠成像分析儀觀察并拍照電泳結果。

1.5 斑馬魚胚胎的孵化

斑馬魚在(25±1)℃、光暗比為14 h∶10 h實驗室中培養。實驗前1天將一定數量的成年斑馬魚按雌、雄1∶1混養于產卵缸中,放于暗室,次日早晨取出,斑馬魚見光產卵。收卵,清洗去除雜物和死卵。

1.6 配合物對斑馬魚胚胎的毒性實驗

將一定濃度的配合物溶液2 m L依次加入24孔板細胞培養板中,每個濃度做8個平行,放入溫度(27～28)℃的恒溫水浴中,取目測健康的5 hpf(hours post fertilization)囊胚期斑馬魚胚胎,每孔放5粒,以溶劑空白做對照。每隔2 h去除死的斑馬魚胚胎。在體式顯微鏡下觀察記錄24和72 hpf時的胚胎死亡數及72 hpf的胚胎孵化數。

2 結果與討論

2.1 配合物與DNA作用的紫外光譜分析

DNA的堿基及磷酸氧是許多藥物的作用位點,與藥物作用后往往會導致其特征峰發生位移和峰強度的變化,通常情況下DNA與化合物發生了作用大多數會在電子吸收光譜有所表現,據此可粗略判斷化合物是否與DNA發生了作用[12]。如圖1所示,在分別加入配合物1和配合物2后,DNA的吸收峰位置發生移動,吸收強度降低,配合物濃度增大,減色效應逐漸增大。其中在201 nm處的吸收峰分別紅移2、1 nm,峰位置移動較小,減色率分別為40.1%、36.1%。在258 nm處的吸收峰分別紫移2、1 nm,減色率分別是40.8%、27.0%。比較金屬配合物溶液中加入DNA前后的電子吸收光譜,如果加入DNA后吸收峰紅移、吸光度減小,則表明配合物與DNA發生了插入作用[13]。由圖2所示,因配體不同,配合物1的紫外光譜與配合物2的明顯不同,在分別加入不同濃度的DNA后,配合物的電子吸收光譜峰強度減弱,峰位置發生了紅移,且由減色率可以看出配合物1中電子吸收光譜變化比配合物2大(請注意圖2中配合物2的縱坐標遠小于配合物1的),可初步判斷配合物1與DNA之間的插入作用較強[12-13]。

圖1 銅-司帕沙星配合物對DNA紫外光譜的影響Fig.1 Effect of comp lexes on the electronic absorption spectra of DNA

圖2 DNA對銅-司帕沙星配合物紫外光譜的影響Fig.2 Effect of DNA on the electronic abso rp tion spectra of comp lexes

2.2 配合物對EB-DNA體系熒光光譜分析

EB是1種熒光染料,它本身熒光極弱,與雙鏈DNA發生嵌插作用后,熒光吸收峰的熒光強度大大增強。當EB與DNA發生作用的配合物共存時,可能發生競爭反應,從而影響EB與DNA的相互作用,使得DNA-EB體系的熒光光譜發生變化,因而EB可作為配合物與DNA作用的結構探針[15]。配合物1加入EB-DNA體系后,隨著配合物濃度的增大,EB-DNA體系的熒光逐步猝滅(見圖3),由此可以認為配合物分子將部分EB從EB-DNA復合物中擠出,發生插入作用[7]。不同濃度配合物2加入EB-DNA體系,對體系熒光光譜影響不明顯,說明配合物2與DNA之間存在比較弱的插入作用。這是因為插入方式要求配合物的插入配體具有較好的平面性、適中的平面面積和疏水性[13-14],而配合物2中的1個司帕沙星配體被鄰菲羅啉取代后得到的配合物1的結構更符合此要求。

圖3 配合物濃度對EB-DNA體系的熒光強度的影響Fig.3 Fluorescence spectra of EB-DNA system under different concentrations of comp lex 1 and comp lex 2

2.3 配合物對DNA的切割作用

完整的pBR322質粒DNA通常呈共價閉環的超螺旋型(FormⅠ),當其中1條鏈上出現1個切口(即單鏈斷裂)時就變成開環缺刻型(Fo rmⅡ),當2條鏈在同一位置都發生斷裂時就變為線型(FormⅢ)。pBR322 DNA的3種形式在電泳上有完全不同的遷移率,FormⅠ最快,Fo rmⅢ次之,Fo rmⅡ最慢,以此可研究物質對DNA的斷裂作用[16]。如圖4所示,在p H為7.60,溫度為37℃的條件下,以抗壞血酸做還原劑時(濃度為配合物的50倍),2種銅-司帕沙星配合物均可以將共價閉環的超螺旋構型(FormⅠ)的pBR322質粒DNA切割成開環缺刻構型(FormⅡ),配合物1還切割出線型(Fo rmⅢ),而且隨著配合物濃度的增大,對DNA的切割活性顯著增強。從作用時間來看,作用10 min時,配合物1已經對pBR322 DNA有顯著作用,而配合物2對pBR322質粒DNA未表現出顯著切割作用;作用時間40 min時,當配合物1濃度大于2.5μmol·L-1時,將Ⅰ型DNA全部轉變為Ⅱ型DNA,配合物1濃度為40μmol·L-1時將Ⅰ型DNA轉變為Ⅱ型和Ⅲ型,而配合物2只是將Ⅰ型DNA部分轉變為Ⅱ型,但沒有切割出Ⅲ型。可見配合物1對DNA的切割活性比配合物2更強。

圖4 37℃,在10 mmol·L-1 Tris-NaCl/1 mmol·L-1 EDTA(p H=7.60)緩沖溶液中,在抗壞血酸(濃度為配合物濃度的50倍)存在下配合物濃度對pBR322 DNA(125 ng)切割活性的影響Fig.4 Agarose gel eletropho resis patterns fo r the cleavage of pBR322 p lasmid DNA by two comp lexes.Conditions:0.025μg·L-1 DNA;50 fold asco rbic acid;10 mmol·L-1 Tris-NaCl/1 mmol·L-1 EDTA buffer,p H=7.60;at 37℃

2.4 配合物對斑馬魚胚胎的作用

斑馬魚胚胎發育分6個時期:卵裂期,囊胚期,原腸胚期,分裂期,成形期,孵化期[17]。其中囊胚期是細胞高度分裂期,在作用物質的壓力下可能使胚胎在進入外包期前就停止發育,并伴隨著胚盤細胞的損毀和卵凝結[18],選擇5hpf囊胚期作為作用的開始點,還可以從一定程度上避免受精過程的不確定性或孤雌生殖[19]。成形期和孵化期是胚胎發育的后期,在發育毒理學上有特殊意義。為了比較配合物的生物毒性,本實驗選擇配合物對斑馬魚胚胎在成形期24 hpf時的致死率和孵化期72 hpf時的半數致死濃度和孵化率作為評價為指標。由圖5(a)可以看出,配合物1對斑馬魚胚胎24 hpf的死亡率的影響作用高于配合物2。對斑馬魚胚胎在72 hpf時孵化率影響如圖5(b)所示,隨著配合物濃度增大,孵化率迅速降低,兩者在72 hpf時對胚胎孵化率影響大小為配合物1>配合物2,配合物對斑馬魚胚胎的半數致死濃度分別是15.3 mg·L-1,18.6 mg·L-1。綜上可見2種配合物對斑馬魚胚胎毒性作用順序為:配合物1>配合物2,說明配合物中1個司帕沙星換成鄰菲啰啉后,與DNA作用增強的同時,配合物的生物毒性也有所增強。以上結果與熒光光譜的數據一致,表明配合物的生物毒性與配合物與DNA分子之間的插入作用存在一定程度的關聯。

圖5 配合物濃度對斑馬魚胚胎影響Fig.5 Effect of different concentrations of the two comp lexes on zebrafish embryos

3 結語

通過比較Cu(sf)phenCl和Cu(sf)2與鮭魚精DNA結合作用及其對pBR322質粒DNA的切割作用,證實Cu(sf)phenCl對DNA具有更強的活性,對斑馬魚胚胎的毒性也更大。因此,若作為潛在的藥物,需進一步考察其藥物毒性。

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Comparisons of DNA Binding and Biotoxicity of Two Cu(Ⅱ)-Sparfloxacin Complexes

FU Huai-Zhou1,L IU Xiang-Wei1,ZHANG Qian-Qian1,L ILing1,ZHANG Dong-M ei1,N IU Shu-Yan2
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266100,China;2.College of Chemistry and Molecular Engineering,Qingdao University of Science and Technology,Qingdao 266042,China)

The interactions of two Cu(Ⅱ)-sparfloxacin comp lexes Cu(sf)phenCl and Cu(sf)2(sf refers to sparfloxacin anion)with DNA were investigated by electric absorp tion spectroscopy,fluorescence spectroscopy and gel electrophoresismeasurements.For the first time,the biotoxicity of the comp lexeson zebrafish embryoswas determined,and the resultswere compared.The spectroscopic studies indicated that the binding ability of the complex Cu(sf)phenCl was greater than that of Cu(sf)2,and gel eletrophoresis revealed that its cleavage activity(cleave pBR322 DNA in the presence of ascorbic acid as a reducing regent)was greater too.In the meantime,the bio toxicity of the comp lex Cu(sf)phenCl on zebrafish em bryoswas also greater than that of Cu(sf)2.

Cu-sparfloxacin comp lex;DNA binding;gel electrophoresis measurements;zebrafish embryo;bio toxicity

O614.2

A

1672-5174(2011)7/8-144-05

國家自然科學基金項目(21075073);中國海洋大學實驗室研究基金項目(SYS200905)資助

2010-10-10;

2011-05-18

付懷洲(1986-),男,碩士生。E-mail:fuhuaizhou@163.com

**通訊作者:E-mail:qqzhang@ouc.edu.cn

責任編輯 徐 環