乳酸菌高密度培養及其在產品中保持高密度的研究

李秋琴，王世杰，陸淳，于景華

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2.石家莊君樂寶乳業有限公司，石家莊 050221）

乳酸菌高密度培養及其在產品中保持高密度的研究

李秋琴1，王世杰2，陸淳2，于景華1

（1.天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2.石家莊君樂寶乳業有限公司，石家莊 050221）

制備高密度菌數含量的活性乳酸菌飲料和高活性乳酸菌制劑的一個重要前提是實現乳酸菌高密度培養，另則是采取一定的方法保持產品保質期內乳酸菌的活性與數量。綜述了國內外不同乳酸菌高密度培養的技術和現狀，以及如何防止產品益生菌活力下降的措施。

乳酸菌；高密度培養；菌活力

0 引言

益生菌產品的擴大和其功效備受關注。2003年歐洲食品與飼料菌種協會（EFFCA）定義益生菌為：指當攝入充足的數量后，對宿主產生一種或多種有論證的功能性健康益處的微生物，強調了益生菌的數量是其發揮益生功效的前提。益生菌攝入量達108個/天的水平[1]，可起到降低某些腸道疾病的發病率、持續時間和病情嚴重性的效果，所以，無論是乳酸菌飲料還是益生菌酸奶或是微生態制劑，實現益生菌體的高密度是首要條件。

也有大量實驗表明，益生菌在牛奶中的生長不好，加上冷藏過程死亡的部分，造成發酵奶中的數量較低，而數量是其起到保健功能的前提，因此高密度培養和產品保質期內降低菌體死亡率的研究才是一套完整的乳酸菌高密度培養技術。

1 乳酸菌高密度培養的優化策略

1.1 菌種

在生產高密度高活性益生菌發酵乳制品和微生態制劑時，我們面臨著眾多的挑戰。益生菌在運載系統中的存活率決定于菌株的選擇；菌種間的互作；代謝產物的生成量，產品的最終酸度等一些因素。對于高密度培養，菌種本身的特性是影響高密度的一個首要因素，因此選擇合適的菌株是非常關鍵的環節，由于菌種的不同，其所能達到的最高濃度將受到很大的影響。

目前國內外學者主要對如下乳酸菌進行了高密度培養的研究（見表1）。

1.2 培養基

培養基成分的選擇一直是改善乳酸菌生長的手段，經常使用增菌培養基包括配制培養基（如MRS、M17等）、乳基質培養基、乳清基質培養基，后兩者常常配合以其他生長因子方可使用，除此之外，酵母粉、蛋白胨和乳蛋白，乳清粉，大麥粒等的復合培養基也常用于乳酸菌的培養[17，18]。

國內對于乳酸菌高密度培養的研究主要集中于增殖培養基的研究方面，對于各種乳酸菌增殖培養基的研究報道很多，包括優化的合成培養基，在MRS或M17等合成培養基的基礎上改良以達到增殖的目的；添加各種提取物或植物蛋白作為增殖因子，如番茄汁、平菇汁、肝浸汁、胡蘿卜汁、海帶汁、麥芽汁、玉米漿、燕麥片等[19-22]。吳祖芳通過添加番茄汁培養Lactobacillus H17，明顯有促進菌體生長的作用[9]。蛋白水解活力影響乳酸菌的增殖速度，因此水解大豆蛋白也作為一個增殖因子[3]。李丹丹驗證了牛蒡菊糖對雙歧桿菌有明顯增殖作用[23]。另外LAB合成能力有限，需要多種氨基酸和維生素維持生存。

表1 高密度培養的菌株

1.3 基礎培養條件

培養條件控制主要是指對培養溫度、pH值和對氧氣的需求值等可能對乳酸菌生長產生影響的環境因素的控制。許多研究者在進行乳酸菌高密度培養時都要考察菌株的最適生長溫度，馮鎮等的兩段式變溫培養乳酸菌的研究，認為變溫培養比單一培養生物量和發酵活力都有所提高[24]。乳酸菌生長的最適pH值也因種屬和來源的不同而有差異，許多研究表明乳球菌的最適生長pH值在6.0～6.3；乳桿菌在微酸性環境中生長更好，大多數情況下最大比生長速率通常在pH值5.5～6.0。國外學者對雙歧桿菌的研究表明光對其生長也有一定的影響[25]。

1.4 乳酸菌培養模式及控制

乳酸菌依靠代謝碳源產生乳酸的途徑來獲取能量，隨著菌體的繁殖，乳酸不斷產生并導致pH值降低，達到一定程度時，即使營養成分充足也會抑制乳酸菌的進一步生長，因此如何克服乳酸的抑制作用是實現乳酸菌高密度培養的關鍵，目前國內外關于乳酸菌HCDC，都是圍繞著如何減輕低pH值和乳酸積累對菌體的抑制展開研究,目前有以下幾種方法：

1.4.1 培養基緩沖鹽法

緩沖鹽法是向乳酸菌的培養液中加入緩沖鹽，以調節和控制培養液的酸度使其pH保持一定的范圍，促進乳酸菌的生長繁殖。乳品加工廠一般采用緩沖鹽有檸檬酸鹽、磷酸鹽，乳蛋白也有一定的緩沖作用。馮友軍等[26]用質量分數為10%檸檬酸(鈉)，5%乙酸(鈉)和2%丙酮酸鈉按一定比例復合而成的緩沖體系使乳酸菌菌體培養的發酵終濃度從2.22×108mL-1提高到1.32× 109mL-1。由于緩沖鹽的緩沖作用有一定的范圍而有所限制。

1.4.2 中和劑法

中和劑法是通過流加堿液中和乳酸菌代謝產生的乳酸，解除低酸度的抑制作用。該法簡便易行，用于產酸菌高密度培養，是目前應用最廣泛的一種方法。常用的中和劑有NaOH、氨水、Na2CO3等。閔偉紅等人用堿性中和和分批補料的復合作用使保加利亞乳桿菌達到9.02×1011mL-1的高濃度[4]。研究表明對于植物乳桿菌一般化學中和劑法比緩沖鹽法更利于其生長[27]。

由于進行pH值控制培養時，加入堿液，一方面引起營養培養基的稀釋，一方面導致乳酸鹽的積累，無法從根本上去除高濃度乳酸、乳酸鹽的抑制作用。

1.4.3 補料分批培養法

補料分批培養（又稱流加培養）指在發酵開始后或者分批培養的某些階段以某種方式間歇地或連續地補加一種或幾種新鮮培養基，延長菌體生長時間的培養方式。可分為兩種基本模式：無反饋調節和反饋控制調節。在幾種高密度培養方法中，補料分批技術研究得最廣泛也最常用，可分為4種類型：間歇培養，連續培養，指數添加培養，饋料式培養，在分批培養中主要是通過控制溫度、pH值、培養基成分及其流加速度來達到高密度。Zhang Y[28]等人研究了pH值反饋調節添加培養基生產乳酸的方法，乳酸產量、干細胞重比一次性培養分別有所提高，此方法簡單，容易操作，工業化可利用。

在產物(或副產物)不會對菌體生長和產物形成造成強烈抑制時補料分批技術有很好的應用價值，培養過程發酵液中的活菌密度較低，為其不足之處。

1.4.4 萃取發酵

萃取發酵是通過原位去除發酵代謝產物來降低抑制的方法。乳酸菌發酵代謝的一些產物尤其是乳酸使得其所處的環境惡化，抑制了菌體的生長，萃取發酵正是利用了這個原理，但由于萃取液對菌體有影響而且在萃取的過程中會損失一些菌體細胞，這方面的報道很少。

1.4.5 固定化法

固定化方法是將活細胞固定在某種載體上，然后將載體至于培養體系中，以達到高密度培養。細胞固定化載體微生物生長提供了充足的的空間，保證了生物反應器內較高的細胞濃度使得反應速度加快，從而有較高的生產力，且細胞被固定不會產生細胞流失現象，固定化細胞可多次重復使用，防止營養基質的浪費，但對于好氧菌來說，O2是其瓶頸。

Doleyres Y[17]研究長雙歧桿菌利用結凝膠固定化進行培養，得出固定化培養菌體數是細胞懸浮的9.5倍。Yang S T等[29]人研究了通過纖維填充床反應器連續生產單克隆抗體，利用纖維固定細胞，比在液體懸浮液中的細胞有更高的活力和低凋亡率，并且纖維基質可有選擇性的保留健康的、無凋亡的細胞，排出凋亡的和死的細胞，保證了長期培養的穩定性，認為此反應器在達到高細胞密度，生產力，產物濃度方面有很好的效果，早實現工業化動物細胞培養的應用很有潛力。

1.4.6 透析培養

透析培養通過半透膜有效地去除培養液中有害的小分子代謝產物，而只保留細胞和高分子產物，同時向培養液中提供新鮮營養物質的培養方法。最熟悉的例子就是Osborne在1977年首次將透析用于乳酸桿菌培養，獲得了1×1011mL-1的高菌體密度,相當于30～40 g/L[30]。

透析培養采用提供營養的營養液和維持滲透壓的無機鹽溶液分開的分配模式，可達到較高的菌體密度，也減少了營養物質的損失，且透析培養過程中透析膜不易被阻塞。但是由于其設備組件投資較大，不易應用于實際生產中。

1.4.7 細胞循環連續培養技術

細胞循環培養法是通過某種方式將細胞保留在培養體系中的培養方法，和固定化法有一些相似之處，細胞循環培養法可以通過膜過濾、沉降、離心的方式將細胞保留[31]。膜過濾培養是在普通培養裝置上附加一套膜過濾系統，用泵將培養液強制流過膜，把菌體截留，濃縮后的培養液返回反應器中，再添加新鮮培養基。膜過濾培養除去生長抑制物或代謝阻遏物不損失細胞；相比固定化細胞培養不存在傳質阻力。

隨著膜技術的廣泛應用，膜組件及裝備和集成技術也得以迅速發展和不斷完善，然而膜的污染和劣化始終是制約膜技術發展的瓶頸之一。早在1988年前分批培養就應經商業化了，且成為當時的唯一，而透析培養和細胞循環培養由于其操作難點和附加設備而沒實現商業化[32]。國內膜生物反應器的發展還不成熟，這方面的報道很少，陸愛華等對中空膜纖維組件在乳酸菌的高密度培養保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的應用進行了初步探討，結果顯示中空膜纖維組件在乳酸菌的高密度培養的應用方面還存在一定問題，有待于進一步研究[33]。韓亦龍對陶瓷微濾膜的研究中，因受到過濾時操作條件的限制，導致過濾時死亡率太高[34]。

2 延長乳酸菌存活期的方法

高活性乳酸菌制品的前提是要對乳酸菌進行高密度培養，另外保持其活性及在活性乳制品中的存活率也是非常重要的，然而由于益生菌的自身生長特性及周圍環境因素的影響，導致進入市場的產品中活菌含量很低。因此，如何提高乳品中益生菌活菌數量已成為商業中的重點研究課題。

影響發酵乳中益生菌的存活的因素有菌株、pH值、過氧化氫、存儲環境、乳酸和乙酸代謝物的含量、溶解氧量、緩沖液等[35]。提高益生菌穩定性的方法：菌株的選擇，溶氧量的控制，微囊化，應激適應，添加促生長因子，緩沖液，包裝材料的選擇等。

2.1 菌株的選擇

大部分“益生菌”缺乏耐酸性，難以抵抗胃液的強酸作用，根本無法到達腸道發揮作用。有學者篩選出一些耐酸性較強的菌種[36]或者通過一些方法例如紫外線誘變菌種使其耐酸，不同的菌株在酸和膽汁中的生存狀況不一樣，如6種雙歧桿菌菌株中，長雙歧桿菌和假長雙歧桿菌對酸的耐受性最好；長雙歧桿菌、假長雙歧桿菌和嬰兒雙歧桿菌對膽汁的耐受性最好；而嬰兒雙歧桿菌在酸性條件下存活率非常低[37]。所以選擇合適的耐酸耐膽鹽的菌株，有助于提高發酵乳中益生菌的生存能力。

2.2 溶氧量的控制

氧毒性被認為是導致酸乳中益生菌存活數量損失的重要因素，且一般認為雙歧桿菌非常容易受到氧氣的影響[38]。Miller等發現在酸乳貨架期中的溶氧持續增長情況下，雙歧桿菌的數量較好的保持在建議的標準數106之上，這與我們通常的雙歧桿菌嚴格厭氧易受到氧毒害的觀點矛盾[39]。雖然氧毒性被廣泛認為與酸乳中的益生菌的低存活有關，但是沒有很好的證據來支持它。

現在采用降低氧毒性的方法有采用高好氧的嗜熱鏈球菌來保護益生菌，采用添加半胱氨酸和抗壞血酸作為酸乳中的除氧劑，還有就是采用以聚苯乙烯為基礎物質的阻氣材料作為發酵乳的包裝。但也有研究證明添加抗壞血酸對雙歧桿菌的數量影響不大。另外酸乳中添加抗壞血酸對酸乳質地和營養性能上產生有害影響。

2.3 微囊化

微膠囊化是將活性細胞包裹于一種壁材中以保護其不受到周圍不利環境的影響的技術，例如對氧、胃酸、膽汁的隔離，保持菌活力的新技術有微膠囊化和雙層包埋方法，對益生菌進行包埋，可提高食品中益生菌的穩定性和存活能力；益生菌的雙層包埋技術是在益生菌表面包覆蛋白質，再包一層特殊膠體，膠體在強酸性的胃酸中凝結，保護益生菌，膠體在益生菌進入十二指腸時，自然分解溶化，釋放益生菌，而第二層的蛋白質就會促進益生菌與腸壁纖毛附著，同時提供益生菌繁殖所需要的營養[40]。Chandramouli V等[41]對嗜酸乳桿菌進行了微膠囊化，認為微膠囊方法可有效的保護乳酸菌對付不利的胃酸條件。Charalampopoulos D等[42，43]提出可采用谷物組分例如淀粉作為膠囊材料以改變他們的穩定性和存活率，且指出谷物提取物對乳酸菌的保護作用可能主要是糖的存在。Ding W K，Shah N P等[45]做了一系列微膠囊乳酸菌存活率的研究，指出藻酸鹽，黃原膠，卡拉膠等組成的微膠囊劑可明顯改善益生菌的存活率[44]，且改進了一種乳酸菌微膠囊包埋的方法，使乳酸菌的存活率升高了一個數量級。Brinques G B[46]對植物乳桿菌進行了研究，未包埋細胞和包埋細胞在模擬腸胃、冷藏環境和酸奶中的數量變化在模擬腸胃中沒有顯著的差異，且數量下降很多，在冷藏和酸奶中的變化，二者有差異，得出微囊化對益生菌在冷藏酸奶中的存活有一定的保護作用。

2.4 添加生長促進因子

一些物質會促進益生菌的生長，例如低聚糖類，蛋白水解物，果蔬汁。

張曉蕾等[47]通過在產品中添加酪蛋白水解物來保持益生菌酸奶中的菌活性，選擇優化的酪蛋白水解產物對發酵牛奶中益生菌的生長及維持其生存能力均會產生積極地促進作用；K.Kailasapathy[48]研究了一些水果制劑對嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌在保質期中數量的影響，認為在添加10 g水果制劑時，不同的水果對嗜酸乳桿菌數量有不同的效果，但不論是添加5 g還是10 g對雙歧桿菌的數量沒有顯著影響。

2.5 應激適應

應激適應就是利用誘導的方法，增強其對付不良環境的能力，使其很快產生適應性細胞反應。氧化應激適應通常是在溫度和發酵培養基都為微生物的最適狀態進行。

3 結束語

高密度越來越重要，首先益生菌發酵食品和益生菌制劑需求隨著消費者對健康食品的意識不斷加深而日益旺盛。而我國還沒有很成熟的乳酸菌發酵劑的生產。另外工廠并不僅是把乳酸菌簡單的作為發酵劑，而是作為益生菌成分加入到產品，因為生物量很重要。酸乳制造商確保在酸乳制備時加入足夠劑量的益生菌是必要的，因此無論是益生菌發酵食品、發酵劑或微生態制劑，實現益生菌體的高密度是首要條件，保持其活性的研究也同樣重要。

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Research on high cell density cultivation and survival of lactic acid bacteria in products

LI Qiu-qin1,WANG Shi-jie2,LU Chun2,YU Jing-hua1
(1.Department of food engineering and biotechnology,Tianjin university of S&T,Tianjin 300457,China;2.Shijiazhuang Junlebao dairy Co.Ltd,Shijiazhuang 050221,China)

High cell density cultivations(HCDC)of lactobacillus are very important as LAB not simply as starter but also as probiotics ingredient to add to beverage or other dairy product,and keeping the LAB survival by certain measures is also more important.This article focuses on the current knowledge of HCDC of LAB and some measures to keep the probiotics activity in the products.

Lactic acid bacteria;high cell density cultivation;probiotic activity

Q939.11+7

A

1001-2230（2011）05-0021-05

2011-01-14

石家莊市科學技術研究與發展計劃（10117148A）；益生乳酸菌發酵劑生產技術的研究及產業化示范（BADC20091B02）。

李秋琴（1986-），女，碩士研究生，研究方向為食品加工技術。

于景華