乳及乳制品中動(dòng)物水解蛋白L-羥脯氨酸的檢測(cè)技術(shù)

李洋，滿朝新，趙秋蓮，劉珊珊，劉穎，董鑫悅，姜毓君

（國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150086)

乳及乳制品中動(dòng)物水解蛋白L-羥脯氨酸的檢測(cè)技術(shù)

李洋，滿朝新，趙秋蓮，劉珊珊，劉穎，董鑫悅，姜毓君

（國(guó)家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱 150086)

介紹了檢測(cè)乳及乳制品中L-羥脯氨酸的常用方法，主要包括高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定法，毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)法和分光光度法，并對(duì)今后乳及乳制品中動(dòng)物水解蛋白檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行了分析。

動(dòng)物水解蛋白；L-羥脯氨酸；檢測(cè)；乳及乳制品

0 引言

乳中摻入動(dòng)物水解蛋白是提高乳中蛋白質(zhì)含量的摻假手段之一。動(dòng)物水解蛋白是由動(dòng)物皮革及其制品下腳料等水解得到的蛋白質(zhì)，長(zhǎng)期飲用會(huì)引發(fā)人體中毒，所以，國(guó)家禁止在乳及乳制品中添加皮革水解蛋白。L-羥脯氨酸是動(dòng)物水解蛋白中膠原的特征性氨基酸之一，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)相對(duì)穩(wěn)定[1]，而乳中是不含這種氨基酸的。因此，可以將L-羥脯氨酸的有無(wú)作為檢測(cè)乳及乳制品中是否摻入動(dòng)物水解蛋白的標(biāo)示物[2]。

目前，針對(duì)L-羥脯氨酸的測(cè)定方法主要有高效液相色譜法[3]、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[4-5]、氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定法[6]、毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)法[7]、分光光度法[8]，本文對(duì)相關(guān)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行了綜述。

1 檢測(cè)技術(shù)

1.1 柱前衍生高效液相色譜法

高效液相色譜在分析實(shí)驗(yàn)室已越來(lái)越普及。柱前衍生是一種先將氨基酸轉(zhuǎn)化成衍生物，再進(jìn)行色譜分離的衍生方法，柱前衍生高效液相色譜法分析L-羥脯氨酸，常用的柱前衍生試劑是2,4-二硝基氟苯(DNFB)[9，10]，該衍生試劑衍生得到的衍生物穩(wěn)定性好，并且過(guò)量的DNFB對(duì)分析沒(méi)有影響。色譜柱通常采用C18柱，衍生條件為樣品與衍生劑渦旋混合10～15 s后室溫下放置1 min，然后在55℃烘箱內(nèi)加熱10 min。檢出限可達(dá)到2.5 mg/L[9]。該方法具有較高的準(zhǔn)確度和良好的重現(xiàn)性，具有分析時(shí)間短，成本低，重現(xiàn)性好，適用樣品范圍廣等特點(diǎn)，可作為乳及其他乳制品中L-羥脯氨酸含量的檢測(cè)方法。

金蘇英[11]等采用柱前衍生反相高效液相色譜法測(cè)定奶粉及其他乳制品中L-羥脯氨酸。樣品經(jīng)酸水解后，用6-氨基喹啉基-N-羥基琥珀酰亞氨基甲酸酯（AQC試劑）衍生水解樣品中的L-羥脯氨酸，以磷酸鹽緩沖溶液、乙腈、水梯度洗脫，通過(guò)symmetry C18柱將L-羥脯氨酸與其他18種氨基酸分離，在248 nm波長(zhǎng)下用紫外檢測(cè)器檢測(cè)。測(cè)定結(jié)果為，在濃度為0～2.05 mmol/L范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈良好的線性關(guān)系（r= 0.9991），加樣回收率為95.1%～101%，方法精密度RSD（n=7）為1.3%。該方法具有簡(jiǎn)單、穩(wěn)定、靈敏度高、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。

唐志毅[12]等采用鄰苯二甲醛和芴甲基氯甲酸酯兩個(gè)衍生劑測(cè)定尿中的羥脯氨酸，以C8柱為色譜柱，無(wú)雜質(zhì)干擾，特異性好；研究者也有以異硫氰酸苯酯(PITC)為衍生試劑，測(cè)定了保健食品中游離和非游離的L-羥脯氨酸[13]。這兩種方法也可以在乳及乳制品中L-羥脯氨酸的檢測(cè)中加以應(yīng)用。

1.2 高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)法

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC/MS）的研究已經(jīng)有了約30年的發(fā)展歷史，并且在分析氨基酸方面得到了較多的應(yīng)用。質(zhì)譜具有靈敏、專屬、能提供分子量和結(jié)構(gòu)信息的特點(diǎn)，是高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用將液相色譜與質(zhì)譜相結(jié)合的方法。隨著HPLC/MS的發(fā)展，其在化工、生物、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域中均得到了廣泛的應(yīng)用。

王一紅等[5]采用HPLC/MS法，用電噴霧ESI源,在正離子模式下建立了18種游離氨基酸的測(cè)定方法，通過(guò)選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM）方式對(duì)18種氨基酸的母離子及子離子進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并用三級(jí)四極質(zhì)譜測(cè)定。測(cè)得結(jié)果回收率為95%～104%，相關(guān)系數(shù)0.9931～0.9999，檢出限為0.5～8 mol/mL。

1.3 氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定法

氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定法是一種離子色譜柱后衍生法，經(jīng)過(guò)陽(yáng)離子交換柱的分離作用，能使L-羥脯氨酸與其它氨基酸分離，L-羥脯氨酸再與茚三酮反應(yīng)生成黃色產(chǎn)物，并在波長(zhǎng)440 nm檢出。使用氨基酸自動(dòng)分析儀來(lái)分析L-羥脯氨酸，在其標(biāo)準(zhǔn)分析條件下即可實(shí)現(xiàn)L-羥脯氨酸與其他氨基酸的完全分離，因而該方法更加準(zhǔn)確、快速，并且其靈敏度和自動(dòng)化程度很高。利用氨基酸自動(dòng)分析儀法測(cè)定乳及乳制品中L-羥脯氨酸，可以直接進(jìn)行對(duì)L-羥脯氨酸的分析，避免了氨基酸衍生產(chǎn)物的多樣性，也不用考慮樣品中氨基酸衍生不徹底等問(wèn)題，該方法樣品處理簡(jiǎn)便易操作，能快速、準(zhǔn)確地判斷乳及乳制品中是否添加了動(dòng)物水解蛋白。并且，在測(cè)定L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度的同時(shí)，又可以同時(shí)測(cè)定出其他的16種水解氨基酸。

張秀堯[14]等人采用氨基酸自動(dòng)分析儀法檢測(cè)乳及乳制品中L-羥脯氨酸，將樣品酸水解后，直接用氨基酸自動(dòng)分析儀檢測(cè)。測(cè)定結(jié)果檢出限為0.3 mg/L，加標(biāo)回收率在96.8%～107%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.40%～4.9%。所以，氨基酸自動(dòng)分析儀法適合于乳與乳制品中是否添加動(dòng)物水解蛋白的鑒定，具有非常好的應(yīng)用前景。

曾暖茜[15]等人用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定乳制品中L-羥脯氨酸，當(dāng)L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度在5～30 mg/L范圍內(nèi),L-羥脯氨酸的質(zhì)量濃度與峰面積之間線性關(guān)系良好，實(shí)驗(yàn)測(cè)得樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%，加標(biāo)回收率為94.9%～105%，平均回收率為98.4%。

1.4 毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)法

毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)法的原理是膠原蛋白堿水解生成氨基酸，經(jīng)異硫氰酸熒光素(FITC)衍生，再通過(guò)LIF-CE分離后，測(cè)定膠原蛋白特異性氨基酸L-羥脯氨酸。毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)可大大提高測(cè)定的靈敏度，從而滿足生物樣品測(cè)定的要求。已有諸多報(bào)道采用毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)法測(cè)定氨基酸，并取得滿意的分析結(jié)果[16]。而將該法用于測(cè)定L-羥脯氨酸，國(guó)內(nèi)外僅有少量報(bào)道[17]。

鄒曉莉[7]等采用毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)法分離測(cè)肌腱中的L-羥脯氨酸。將膠原蛋白堿水解生成氨基酸，用異硫氰酸熒光素衍生，采用LIF-CE分離測(cè)定L-羥脯氨酸。測(cè)定結(jié)果為，在0.5～8×103μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，檢出限為0.5 μg/L。相對(duì)遷移率和相對(duì)峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為5.0%和6.1%，加標(biāo)回收率為95%～110%。

1.5 分光光度計(jì)檢測(cè)法

相對(duì)而言，高效液相色譜法和液譜-質(zhì)譜聯(lián)用法所需要的儀器尚未普及，而且成本相對(duì)較高，所以這兩種方法在基層實(shí)驗(yàn)室和某些企業(yè)中會(huì)受到限制，因而需要建立一種實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單、操作簡(jiǎn)便、對(duì)設(shè)備儀器要求較低的實(shí)驗(yàn)方法來(lái)檢測(cè)乳及乳制品中的L-羥脯氨酸，以便于推廣。

分光光度計(jì)法在肉與肉制品中L-羥脯氨酸質(zhì)量濃度測(cè)定中比較常用，在1990年即被列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，并且一直沿用至今。由此發(fā)展而來(lái)的用于乳及乳制品檢測(cè)的L-羥脯氨酸-氯胺T法，其原理是動(dòng)物水解蛋白水解出來(lái)的游離的L-羥脯氨酸可以被氯胺T氧化，生成吡咯類化合物，在一定的溫度下該化合物能與對(duì)二甲氨基苯甲醛生成一種紅色化合物[18]，在可見(jiàn)光波長(zhǎng)下該紅色化合物有一定的吸收，故可通過(guò)分光光度計(jì)來(lái)測(cè)定其質(zhì)量濃度[19]。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單、分析速度較快、應(yīng)用范圍廣泛，其重復(fù)性和檢測(cè)限均可基本滿足要求。戴絢麗等[20]先用鹽酸水解奶粉，然后用氯胺T法測(cè)定了其水解后的L-羥脯氨酸。該方法的線性范圍為0.002～3 μg/L，回收率在90.06%～94.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜5%。

2 結(jié)果與展望

本文所介紹的高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定法、毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)法以及分光光度計(jì)法測(cè)定乳及乳制品中的L-羥脯氨酸，各有優(yōu)點(diǎn)和不足。高效液相色譜法是目前實(shí)驗(yàn)室較為常見(jiàn)的分析檢測(cè)方法，該方法前處理簡(jiǎn)單，具有穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，近年來(lái)在多個(gè)檢測(cè)領(lǐng)域得到了極為廣泛的應(yīng)用；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法也是現(xiàn)階段的一個(gè)重要檢測(cè)方法，但由于其耗材貴、成本高使不少實(shí)驗(yàn)室望而止步，同時(shí)高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法在定量方面與高效液相色譜法相比還有一定差距；分光光度計(jì)法在常規(guī)的實(shí)驗(yàn)室均可以進(jìn)行，該方法前處理和所需實(shí)驗(yàn)設(shè)備更為簡(jiǎn)單，可以快速的檢測(cè)乳制品中的L-羥脯氨酸，但在檢測(cè)靈敏度方面與高效液相法相比還有很大的不足，準(zhǔn)確性較差也使得該方法受到了一定的限制，適用于樣品的初篩。氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定法避免了氨基酸衍生產(chǎn)物的多樣性和氨基酸衍生不徹底等問(wèn)題，樣品處理簡(jiǎn)便易操作，快速、準(zhǔn)確，對(duì)于具備該儀器的實(shí)驗(yàn)室，此方法是一較好選擇。毛細(xì)管電泳-激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法一樣，由于儀器設(shè)備等因素，目前在國(guó)內(nèi)應(yīng)用還不多。

以L-羥脯氨酸為特征性指標(biāo)檢測(cè)乳及乳制品中的動(dòng)物水解蛋白的常用方法。動(dòng)物膠原蛋白的另一個(gè)特征水解產(chǎn)物是羥賴氨酸，但通過(guò)液相質(zhì)譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)羥賴氨酸在植物中也含有[21]，因此也難以作為特征性檢測(cè)指標(biāo)。今后能否將動(dòng)物蛋白水解液中的脂肪酸、有機(jī)酸等作為動(dòng)物蛋白水解特征產(chǎn)物，仍需進(jìn)一步研究。此外，現(xiàn)有檢測(cè)乳及乳制品中動(dòng)物水解蛋白的方法都需要一定的儀器設(shè)備，難以滿足現(xiàn)場(chǎng)執(zhí)法等快速檢測(cè)的需要，因此更為快速有效的檢測(cè)手段（如檢測(cè)試紙條等）也將具有非常廣闊的前景。

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Detection of L-Hydroxyproline of Hydrolyzed animal protein in the milk and dairy products

LI Yang，MAN Chao-xin，ZHAO Qiu-lian,LIU Shan-shan，LIU Ying，DONG Xin-yue，JIANG Yu-jun
(National Dairy Engineering&Technical Research Center，Harbin 150086，China)

This paper reviews several methods to detect the L-hydroxyproline,including high performance liquid chromatography,high performance liquid chromatography mass spectrometry,automatic amino acid analyzer,capillary electrophoresis-laser induced fluorescence detection,and spectrophotometry.In addition，the trends of related techniques to detect hydrolysis of animal protein in milk and dairy products were predicted.

Animal protein hydrolysate；L-hydroxyproline;detection;milk and dairy products

TS252.7

B

1001-2230（2011）05-0047-03

2011-01-20

國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2009BADB9B06）。

李洋(1987-)，女，碩士，研究方向?yàn)槭称钒踩?/p>

姜毓君