植物乳桿菌素抑菌機理的研究

程建軍，李想，郭明若

(1.東北農業大學，哈爾濱 150030；2.雙城雀巢有限公司，哈爾濱 150100；3.佛蒙特大學，美國伯靈頓 05403)

植物乳桿菌素抑菌機理的研究

程建軍1，李想2，郭明若3

(1.東北農業大學，哈爾濱 150030；2.雙城雀巢有限公司，哈爾濱 150100；3.佛蒙特大學，美國伯靈頓 05403)

從植物乳桿菌B-28的代謝產物中分離純化植物乳桿菌素，以蠟樣芽胞桿菌為指示菌，通過測定指示菌細胞結構和細胞中APT、離子量的變化，分析探討植物乳桿菌素的抑菌機理。研究結果表明：當植物乳桿菌素作用于蠟樣芽胞桿菌時，胞內ATP呈現迅速下降趨勢；并迅速釋放出K+和Na+，而且植物乳桿菌素的質量分數與K+和Na+釋放量基本呈現線性正相關。隨著植物乳桿菌素添加量的增加，蠟樣芽胞桿菌細胞裂解率在逐漸提高。而且電鏡觀察發現：植物乳桿菌素作用的蠟樣芽胞桿菌的細胞壁邊緣模糊，菌體細胞變形，部分細胞壁缺失，可看到胞內物質的損失。

植物乳桿菌素；抑菌；機理

0 引言

乳酸菌可產生對食品中微生物具有抑制作用的酸性物質，主要是乳酸菌的代謝終產物及中間產物[1，2]。而且有些乳酸菌還能代謝產生具有抑菌活性的乳酸菌素，這類細菌素主要是Nisin和Ⅱa類細菌素，其抗菌機理的研究結果表明細菌素作用的靶目標是細胞膜。

不同的乳酸菌素由于結構不同，其活性和對細胞膜的作用方式也不同。Nisin的抑菌作用最初被認為是一種表面活性劑；亦有人認為Nisin的作用是由于其中的兩個脫水氨基酸（脫水丙氨酸和脫水丁氨酸）與細菌細胞中酶的巰基發生反應；目前認為除了以上兩種原因外，還存在孔道形成機制[3，4]。Ⅱa類細菌素的抗菌機理在近幾年才逐漸為人們所研究，其主要是由于細菌素吸附在細胞膜上，并形成孔道，使得細胞膜的通透性增加從而引起細胞內各種離子的滲漏和能量物質的消耗，導致細胞解體死亡[5]。

1 材料和方法

1.1 菌株

植物乳桿菌B-28（Lactobacillus plantarumB-28）；從保加利亞傳統發酵小麥飲料中分離得到。蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）。

1.2 主要試劑

XRA細菌細胞釋放劑，螢火蟲熒光素。

1.3 主要儀器設備

電子顯微鏡，BIO-680全自動酶標儀，BHP9505微量光度計，PE-300原子吸收分光光度計，SP-722分光光度計。

1.4 方法

1.4.1 ATP測定

ATP測定由張東聲、Sirugusa和Naghmouchi方法修正后進行測定[6-8]：對數生長期的蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus），1 480 g離心15 min，收集菌體，洗滌后的懸濁液溶于濃度為50 mmol/L（pH值為6.0）的MOPS緩沖溶液中，625 nm的吸光值為0.02。

添加葡萄糖到菌懸液中，終點的濃度達到0.5 mmol/L，5 min后取100 μL樣品加入100 μL緩沖溶液，混合后立即用0.45 μL微量濾器過濾，濾液用于細胞外ATP測定，濾器上的細胞用于細胞內ATP測定，測定結果用作對照。

6 min時，分別添加0.5 mL和1 mL植物乳桿菌素到細胞懸濁液中，每隔5 min，取出100 μL樣品過濾，濾器上的細胞中加入50 μL的細胞裂解液和50 μL的熒光素，迅速攪動3次后，置于微型熒光計中，10 s后的相對光單位（Relative Light Units，RLU）為胞內ATP值。

取50 μL濾液，加入50 μL的熒光素，迅速攪動3次后，置于微型熒光計中，相對光單位RLU為胞外ATP值。以時間為橫坐標，以相對光單位RLU為縱坐標，繪制ATP變化曲線。

1.4.2 細胞裂解率的測定

細胞裂解率測定由Naghmouchi（2006）方法修正后測定[8]：10 mL培養6h在4℃下，10 000 g離心10 min，洗滌后的懸濁液溶于5 mL濃度為20 mmol/L（pH值為6.0）的磷酸鹽緩沖溶液中。

將細胞懸浮液125 μL和25，50，75，100，125 μL的植物乳桿菌素的磷酸鹽緩沖溶液混合，總量保持在250 μL，37℃下培養，測定630 nm的吸光值。細胞裂解率為

式中：At為9 h或12 h的吸光值；A0為開始時的吸光值。以植物乳桿菌素添加量為橫坐標，以細胞裂解率為縱坐標作圖。

1.4.3 細胞離子流出的測定

對數生長期的蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus），4℃下，10 000 g離心10min，菌體細胞用濃度為50 mmol/ L（pH值為6.0）的MOPS緩沖溶液洗滌兩次，溶于質量濃度為2 g/L葡萄糖的MOPS緩沖溶液中，分別添加0.5 mL和1 mL植物乳桿菌素，30℃下培養，每隔5 min，0.45 μL微量濾器過濾后，采用原子吸收分光光度計，根據GB/T 5009.124-2003的方法，測定K+和Na+的總量。以時間為橫坐標，以K+和Na+的質量分數為縱坐標，繪制離子流出曲線。

1.4.4 電鏡觀察細胞的變化

根據楊向科、Beatriz Gonzalez和Naghmouchi方法[8-10]，分別添加植物乳桿菌素500 μL和1 mL的對數生長期的蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus），4℃下，10 000 g離心10 min，收集菌體細胞，4℃下0.05%戊二醛和溶于pH值為7.2磷酸鹽緩沖溶液的2.5%多聚甲醛中固定2 h，樣品每5 min沖洗1次；4次后，用質量濃度為30 g/L瓊脂糖微包埋，4℃下含質量濃度為1 g/L的四氧化鋨的磷酸鹽緩沖溶液固定2 h，洗滌4次后，乙醇梯度脫水、包埋、60℃聚合48 h。切片，磷酸鹽緩沖溶液清洗，乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，電鏡觀察細胞結構變化。

2 結果

2.1 ATP的測定

以時間為橫坐標，以相對光單位RLU為縱坐標，繪制ATP（Adenosine-Triphosphate）釋放變化曲線，結果如圖1所示。

由圖1可以看出：加入了植物乳桿菌素的蠟樣芽胞桿菌胞內和胞外ATP都發生了變化，添加了1mL植物乳桿菌素的胞內ATP在5 min添加后迅速下降，然后呈現緩慢下降趨勢，并趨于平穩；胞外ATP迅速增加；而添加了0.5 mL植物乳桿菌素胞內ATP雖然出現緩慢下降趨勢，但變化幅度明顯小于1 mL植物乳桿菌素添加量時ATP的變化。

這說明了植物乳桿菌素破壞了蠟樣芽胞桿菌的細胞壁，完整細胞內的ATP釋放出來，這個結果與Waite等、Naghmouchi等的研究結果[8，11]是一致的，這可能是由于植物乳桿菌素抑制了依賴于磷酸轉移酶體系的磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的合成，從而造成了胞內ATP缺失。

2.2 細胞裂解率的測定

以植物乳桿菌素添加量為橫坐標、細胞裂解率為縱坐標繪制的植物乳桿菌素在不同作用時間的蠟樣芽胞桿菌細胞裂解率，結果如圖2所示。

圖2 蠟樣芽胞桿菌細胞裂解率

由圖2可以看出，隨著植物乳桿菌素添加量的增加，蠟樣芽胞桿菌細胞裂解率在逐漸提高，作用9 h和12 h裂解率的變化趨勢是一致的。開始時，細菌裂解率增加；然后添加量50～100 μL間保持相對穩定狀態；在100 μL植物乳桿菌素的添加量時，細胞裂解率出現了突越，植物乳桿菌素添加量為125 μL（相當于0.625 mg）時達到了最高，為48.52%。這說明了植物乳桿菌素抑制或殺滅蠟樣芽胞桿菌需要有效的濃度，只有當濃度達到最適時，抑菌或殺菌效果才會達到最佳。

2.3 細胞內鉀、鈉離子流出的測定

以時間為橫坐標，以從蠟樣芽胞桿菌中釋放出的K+和Na+質量分數為縱坐標，繪制離子流出曲線，結果如圖3所示。

由圖3可以看出，因植物乳桿菌素作用而釋放出K+和Na+質量分數在開始時，迅速釋放，5 min后達到穩定狀態；300 μg和150 μg植物乳桿菌素處理的蠟樣芽胞桿菌的K+和Na+釋放量基本呈現倍數，表明了植物乳桿菌素的質量分數與K+和Na+釋放量基本呈現正相關。

圖3中，鈉離子的釋放量高于鉀離子，最高達到了9203 mg/kg，而鉀離子最高只有39.24 mg/kg。這可能是由于蠟樣芽胞桿菌對NaCl具有較強的適應能力，在營養肉湯培養基中就含有質量分數為5%的NaCl，細胞本身就含有較高鈉離子的緣故。植物乳桿菌素可能是通過穿透指示菌的細胞膜來殺死細菌的，當兩肽細菌素相互作用形成兩性的α-螺旋結構而插入指示菌的細胞膜中，形成了鉀離子的選擇性通道[12]。

2.4 電鏡觀察細胞的變化

植物乳桿菌素對蠟樣芽胞桿菌作用的形態結構電鏡觀察結果如圖4所示。由圖4可以看出，圖4（a）和（d）的蠟樣芽胞桿菌細胞壁連續、完整、光滑，結構緊密，細胞質均勻。圖4（b）、（c）、（e）和（f）植物乳桿菌素作用的蠟樣芽胞桿菌細胞壁邊緣模糊，細胞壁上有凹陷，可看到胞內物質的損失，部分細胞壁缺失，菌體細胞變形，有些細胞質甚至解體出現空腔。而且隨著植物乳桿菌素濃度的增加，蠟樣芽胞桿菌細胞壁、細胞膜和細胞質的變化越來越明顯。說明了植物乳桿菌素溶解了細胞壁，對臘樣芽胞桿菌的生長起到了抑制作用。

圖4 電鏡觀察結果

圖4中，（a）、（d）為對照；（b）、（e）為500 μL植物乳桿菌素處理；（c）、（f）為1 000 μL植物乳桿菌素處理。

3 結論

加入了植物乳桿菌素的蠟樣芽胞桿菌胞內ATP呈現迅速下降趨勢，并逐漸趨于平穩；胞外ATP值迅速增加；而添加了0.5 mL植物乳桿菌素胞內ATP值雖然出現緩慢下降趨勢，但變化幅度明顯小于1mL植物乳桿菌素添加量ATP值的變化。

植物乳桿菌素作用而釋放出K+和Na+值在開始時，迅速釋放，5 min后釋放趨于穩定狀態；而且植物乳桿菌素的濃度與K+、Na+釋放量基本呈現線性正相關。

隨著植物乳桿菌素添加量的增加，蠟樣芽胞桿菌細胞裂解率在逐漸提高，125 μL達到了最高，為48.52%。9 h和12 h裂解率的變化趨勢是一致的。

電鏡觀察蠟樣芽胞桿菌細胞，與對照比較，細胞壁邊緣模糊，可看到胞內物質的損失，部分細胞壁缺失、細胞膜破裂，菌體細胞變形；有些細胞質甚至解體出現空腔。而且隨著蠟樣芽胞桿菌培養時間的延長，細胞壁、細胞膜和細胞質的變化越來越明顯。

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Antibacterial mechanism of plantaricin by Lactobacillus plantarum B-28

CHENG Jian-jun1，LI Xiang2，GUO Ming-ruo3
（1.Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.Nestle Shuangcheng Limited Company，Harbin 150100，China；3.University of Vermont，Burlington,VT 05403,USA）

The plantarcin was screened byLactobacillus plantarumB-28.The Bacillus cereus was the indicator bacteria.The antibacterial mechanism of the plantarcin was investigated through the changes of ATP level,ionic content and structure of cell.The results showed:As plantarcin which was screened byLactobacillus plantarumB-28 was added,intracellular ATP levels in energized cells of theBacillus cereusdropped quickly and then tended to be stable,however,extracellular ATP level increased during incubation in the present of plantaricin.The indictor’s cell lysis rate increased when the content of plantaricin was increased.After plantarcin was added,intracellar K+and Na+released quickly.It seemed there was a linear correlation between total amount of ions released and the concentration of plantaricin.Bacillus cereuswere treated by plantaricin,it was clearly seen that its cells wall appeared irregular at the edges by electron microscopy.At that time,their cells were cytomorphosis,cell walls were partially damaged,and intracellular materials were lost.

plantaricin；antibacterial；mechanism.

Q93-33

A

1001-2230（2011）05-0031-03

2011-02-21

程建軍（1969-），男，博士，研究方向為農產品加工。